枳椇子抗肝纤维化作用网络药理学研究*

吾斯曼·艾海提，艾则孜江·艾尔肯

（新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆 乌鲁木齐 830054）

肝纤维化是因肝脏受到长期刺激时，细胞外基质分泌过多沉积导致，是慢性肝炎- 肝纤维化- 肝硬化发展过程中的重要中间环节［1-2］。肝病在我国的发病率呈持续升高趋势，其中慢性肝炎进展为肝硬化的发生率为2%～10%［3］。目前，有研究发现肝纤维化可逆，但临床尚无有效的治疗药物与方法［4］。近年来，中医药在抗肝纤维中显示出显著优势［5］。枳椇子为鼠李科植物北枳椇Hovenia dulcisThunb. 的干燥成熟种子，始载于《新修本草》，具有止渴除烦、清热利尿之功效。现代药理学研究显示，枳椇子可改善模型大鼠肝纤维化程度［6-7］。其能改善肝功能，下调基质金属蛋白酶抑制因子1（TIMP- 1）的表达，进而改善肝脏胶原的降解功能，逆转肝纤维化［8-9］，但枳椇子抗肝纤维化的有效活性物质及作用机制尚待阐明。因此，本研究中基于网络药理学，通过预测分析枳椇子的活性成分及其治疗肝纤维化的靶点、信号通路，探讨其抗肝纤维化的作用机制，以期为临床防治肝纤维化提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 活性成分及靶点获取

以枳椇子为关键词输入中医药系统药理学平台（TCMSP），设口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，检索枳椇子的活性成分，并获取成分靶点，同时借助蛋白质数据库（Uniprot，https：//www.uniprot.org）标准化处理成分靶点。

1.2 肝纤维化靶点获取

以“hepatic fibrosis”为关键词，分别输入GeneCards、人类孟德尔遗传数据库（OMIM，http：//www.omim.org）及疾病关联关系数据库（DisGeNET，https：// www. disgenet.org），检索肝纤维化的靶点并合并，剔除重复靶点后即得肝纤维化潜在靶点。

1.3 抗肝纤维化靶点获取及成分-靶点网络构建

将得到的成分靶点及肝纤维化靶点输入Venny 平台，取交集，即得枳椇子抗肝纤维化的潜在靶点。将枳椇子活性成分及枳椇子抗肝纤维化的潜在靶点一一对应导入Cytoscape 3.7.0 软件中，构建成分-靶点网络，并借助软件分析工具对网络进行拓扑参数分析，节点的节点度（Degree）值越大，代表节点越重要，最后根据Degree值排序筛选靠前的成分为核心成分。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建

将枳椇子抗肝纤维化的潜在靶点导入String 数据库中，设置物种为Homo sapiens，最小交互打分值为0.7，隐藏离散的蛋白，得到PPI 关系。将结果导入Cytoscape 软件中构建PPI 网络，并借助软件分析工具对网络进行拓扑参数分析，根据Degree 值筛选靠前的靶点为核心靶点。

1.5 潜在靶点富集分析

利用R 语言软件对枳椇子抗肝纤维化的潜在靶点进行基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，其中GO 富集分析包括生物学过程（BP）、细胞成分（CC）及分子功能（MF）3个部分。根据P值筛选靠前的结果进行绘图分析。

2 结果

2.1 活性成分及靶点

共得活性成分7 个（见表1），靶点289 个，剔除重复及无标准名靶点后得187个靶点。

表1 枳椇子的活性成分Tab.1 Active components of Hovenia dulcis

2.2 肝纤维化潜在靶点

在 GeneCards，OMIM 及 DisGeNET 数据库分别检索得到6 241，28，63 个肝纤维化靶点，剔除重复靶点后再与上述枳椇子活性成分及靶点取交集，得到枳椇子抗肝纤维化的靶点，详见图1。

图1 活性成分-肝纤维化靶点维恩图Fig.1 Venn diagram of active component-hepatic fibrosis targets

2.3 活性成分-靶点网络

成分- 靶点网络包含172 个节点，258 条边，详见图2，图中红色为枳椇子活性成分，绿色为其抗肝纤维化潜在靶点。表明山柰酚、柚皮素、槲皮素等6个黄酮类化合物为参与抗纤维化过程的核心成分，其在抗肝纤维化过程中起关键作用。

图2 活性成分-靶点网络Fig.2 Active component-target network

2.4 PPI 网络

网络中包含152 个节点，892 条边，其中节点越大，蓝色越深，代表其Degree 值越大，连线越粗代表蛋白间的相互作用越强，详见图3。根据Degree 值得到AKT1，JUN及MAPK3等10个靶点为核心靶点，详见表2。

图3 蛋白-蛋白互作网络图Fig.3 PPI network

表2 核心靶点信息Tab.2 Information of key targets

2.5 富集分析

GO 功能富集分析结果涉及对金属离子的应答、对脂多糖的应答、药物应答、对细菌来源分子的应答、细胞对化学压力的反应等1 877条BP通路（图4 A）；膜筏、膜微区、质膜筏、小窝及细胞器外膜等64个CC通路（图4 B）；核受体活性、配体激活的转录因子活性、DNA 结合转录因子结合、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合及G 蛋白偶联受体活性等163 条MF 通路（图4 C）。KEGG 富集分析结果主要涉及肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素17（IL-17）及晚期糖基化终末产物及其受体（AGE-RAGE）等177条通路（图4 D）。

图4 富集分析结果Fig.4 Results of the enrichment analysis

3 讨论

肝纤维化为慢性疾病，长期刺激可使肝脏结构改变甚至导致肝功能丧失，多种细胞因子及细胞外基质（ECM）在肝纤维的发生发展中至关重要［10］。中医学中根据肝纤维化的病理特征，将其归属于“积聚”“胁痛”等范畴［3］。枳椇子可促进肝星状细胞（HSC）凋亡，减少ECM 的过量堆积，并减少转化生长因子-β1（TGF-β1）及TIMP-1的表达，进而阻滞肝纤维化的发展［11］。本研究中通过网络药理学分析发现，枳椇子主要通过β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素及柚皮素等活性成分发挥疗效。β-谷甾醇能下调活化HSC 中胶原-1 和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA 的蛋白表达水平，防止胶原积累，从而治疗肝纤维化［12］。山柰酚在体内外均能显著抑制胶原的合成和HSC 的活化，显著降低肝组织坏死炎症的评分，抑制激活素受体样激酶5 而减轻肝纤维化［13］；其通过降低丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的活性，减少羟脯氨酸（HYP）的含量及炎性因子水平，进而阻止肝纤维化进展，保护肝组织，这可能与山柰酚抑制β-catenin的表达从而抑制β -catenin/Wnt 通路有关［14-15］。柚皮素可通过阻断氧化应激、炎性反应以及TGF-β-Smad 3和JNK-Smad 3通路，灭活HSC和抑制促纤维化途径减轻肝纤维化［16］。此外，柚皮素可通过抑制内质网应激和自噬改善四氯化碳（CCl4）诱导的大鼠肝损伤［17］。

GO 及KEGG 富集分析结果显示，枳椇子通过对金属离子、脂多糖、药物及细菌来源分子的反应等生物学过程，涉及 AKT1、JUN 及 MAPK3 等核心靶点，调控TNF、IL-17 及AGE-RAGE 等通路发挥抗肝纤维化作用。通过下调AKT1 及p - AKT1 的表达，能抑制PI3K/Akt信号通路的活化，进而促进HSC 凋亡起保护肝纤维化作用［18］。c - Jun 是AP1 激活蛋白（AP1）的一个组成部分，其可被PI3K/AKT 信号通路激活，从而参与HSC的活化和肝纤维化［19］。通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Akt信号通路的磷酸化而抑制LPS 诱导的炎性反应，进而保护大鼠免受肝轴异常引起的肝纤维化［20］。此外，通过下调MAPK，P-MAPK，P38 的蛋白表达水平，抑制MAPK 信号通路，可显著改善CCl4诱导的纤维化［21］。TNF 为一种免疫细胞因子，参与机体免疫功能的调节。通过降低TNF- α 和IL-1β 的表达水平，能抑制HSC 增殖及活化，减少ECM 的生成，增加其降解，进而改善肝纤维化［22］。IL-17作为炎性细胞因子，在各种肝脏疾病中起重要作用，可调节HSC 的活化和肝纤维化进展。3型细胞因子IL-17及IL-22可增强p38丝裂原激活蛋白激酶依赖的TGF-β 信号通路，进而参与肝纤维化［23］。晚期糖基化终末产物（AGE）受体（RAGE）阻断抗体及可溶性RAGE，可抑制AGE-RAGE 信号通路。RAGE 可降低AGE 诱导的HSC 的自噬和活化，进而促进丙型肝炎相关肝纤维化的形成，提示阻断AGE -RAGE 信号可缓解肝纤维化［24］。本研究中网络药理学预测结果与目前相关研究结果一致，提示枳椇子通过AKT1，JUN，MAPK3 调控TNF，IL - 17，AGE - RAGE 信号通路发挥抗肝纤维化作用。

综上所述，枳椇子抗肝纤维化是通过β- 谷甾醇、山柰酚、槲皮素及柚皮素等活性成分作用于AKT1，JUN及MAPK3等核心靶点，调控TNF，IL-17，AGE-RAGE信号通路参与到抗肝纤维化进程中。