叉头框转录因子M1在小细胞肺癌细胞对顺铂耐药中的作用及机制

孙雨晴 汪晶晶 卢进昌 吴超民 杜春玲 周磊

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，是男性人群中因恶性肿瘤致死的第一位疾病，而在女性人群中则位列第二[1]。尽管一些西方国家的肺癌发病率呈下降趋势，但中国肺癌的发病率仍在上升，成为一个重大的公共卫生问题，给社会和经济发展带来沉重负担[2]。小细胞肺癌(SCLC)虽仅占所有肺癌的15%，但危害极大[3]。如未接受积极治疗，SCLC患者的5年生存率低于5%，平均总生存期仅为2～4个月[4]。由于缺乏特定的症状且肿瘤生长快速，确诊时大部分患者已有远处转移，失去手术治疗的机会。目前免疫、靶向治疗等方法在SCLC中取得了较大进展，但化疗仍是SCLC一线和二线治疗的标准方案[5-7]。SCLC对化疗的敏感性总体较高，多数患者在初始治疗后可获得不同程度的缓解，但复发耐药率极高，一旦复发耐药，患者预后极差。因此，阐明SCLC化疗耐药机制，提高SCLC化疗敏感性是目前亟待解决的重要问题。叉头框转录因子M1(FOXM1)是Fox转录因子家族的重要成员，在多种恶性肿瘤发生、发展和耐药的产生过程中具有重要作用。研究显示，FOXM1在DNA损伤后修复(DDR)过程中发挥关键作用。FOXM1参与DNA碱基切除修复、同源重组、DNA连接等多种DDR过程，从而介导恶性肿瘤细胞对化疗药物耐药[8]。既往有研究报道FOXM1在SCLC中有过量表达，并在SCLC对染料木黄酮耐药的过程中发挥关键作用[9]。我们推测FOXM1也有可能是SCLC化疗耐药过程中的关键因子，因此，开展本研究验证这一假设。

材料与方法

1.材料：人SCLC细胞株H446(中国科学院上海细胞所)；噻唑蓝溴化四唑(MTT)试剂(上海碧云天生物技术研究所)；逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；引物合成(美国Invitrogen公司)；放射免疫沉淀测定(RIPA)细胞裂解液(上海碧云天生物技术研究所)；BCA蛋白质定量试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；FOXM1一抗(美国Abcam公司)；GAPDH一抗(武汉三鹰公司)。

2.方法

(1)细胞培养：人SCLC细胞株H446培养条件：37 ℃、5%CO2、10%胎牛血清及RPMI1640培养基。采用顺铂(DDP)浓度梯度法建立对顺铂耐药的H446细胞株(H446/DDP)。

(2)构建FOXM1基因真核过表达载体和细胞转染：收集对数期H446/DDP细胞，加入1 ml Trizol振荡混匀，裂解细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，在Genbank中查到FOXM1基因的mRNA序列，采用Primer Premier5.0软件在其阅读框内设计引物。所用引物序列(由上海英俊生物技术有限公司合成)：FOXM1-F：5’-AAAGAATTCATGAAAACTAGCCCCCGTC-3’；FOXM1-R：5’-AAAGGATCCCTACTGTAGCTCAGGAATAAACT-3’。聚合酶链反应(PCR)产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的基因条带，并与pMD19-T Vector(购自Takara公司)连接，转化感受态大肠杆菌，扩增后提取质粒，EcoRI、BamHI双酶切正确的质粒送测序以验证目的基因的准确性。将测序正确的质粒和pCDH表达质粒载体经EcoRI和BamHI双酶切处理，分别形成线性载体和目的片段，琼脂糖凝胶电泳后分别切胶回收、纯化；然后进行连接反应，并转化感受态大肠杆菌，提取质粒。再次进行EcoRI和BamHI双酶切鉴定，鉴定正确的质粒进行测序以确认目的基因的完整性和准确性。空白载体未插入DNA片段。FOXM1基因过表达载体和空白载体质粒采用Lipofectamin 2000(ThermoFisher)转染细胞。细胞转染前24 h按照每孔约5×105个细胞的密度接种至6孔板中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养24 h，待细胞长至90%～95%汇合，分别将4.0 μg质粒DNA和10 μl Lipofectamin 2000与250 μl不加血清的opti-MEM培养液轻柔混匀，室温孵育20 min后滴加到含有2 ml无抗生素RPMI1640培养基的6孔板细胞中，混匀后置于CO2培养箱中培养4～6 h。然后更换为含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基后继续培养24～72 h后进行检测。

(3)RNA干扰和细胞转染：设计合成靶向FOXM1的小干扰RNA(siRNA，由上海生工公司合成)和阴性对照RNA，序列分别为FOXM1 siRNA(5’-GCCGGAACAUGACCAUCAATT-3’；终浓度为100 nM)和阴性对照RNA(5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；终浓度为100 nM)；siRNA采用Interferin转染细胞，转染过程按照说明书进行，简述如下：在12孔培养皿中接种适量H446细胞和H446/DDP细胞，培养12 h后汇合率达30%～50%；在不同1.5 ml无菌Ep管中分别加入100 μl无血清培养基，再分别加入5 μl Interferin和FOXM1 siRNA(H446-siFOXM1组、H446/DDP-siFOXM1组)或阴性对照RNA(H446-NC组、H446/DDP-NC组)并振荡混匀，室温放置15～20 min；将RNA-脂质体复合物滴加至细胞孔板中，置于5%CO2、37 ℃孵育箱培养6～8 h；然后更换为新鲜培养基，继续培养48～72 h；收集细胞。

(4)MTT比色法测定细胞存活率:分别收获对数生长中期、生长状态良好的H446和H446/DDP细胞，用细胞培养液制成单细胞悬液，整细胞液浓度为5×104个/ml。每孔接种5×103个细胞/100 μl，每组设5个平行孔；每孔加入100 μl DDP(用无血清培养基溶解)使其终浓度为0、2、4、8、16 μM；药物处理48 h后，向每孔加入新鲜配制的MTT液(5 mg/ml)20 μl，继续培养4 h，小心吸去孔内培养上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μl，振荡10 min，结晶物充分溶解后在酶联免疫检测仪上用490 nm波长检测光密度值。

(5)荧光定量PCR(qRT-PCR)检测FOXM1及FOXM1下游基因CDC25B、survivin和cyclin B1 mRNA的表达水平:将细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗后加入1 ml Trizol试剂，摇匀后裂解提取总RNA，根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成互补DNA(cDNA)，进行qRT-PCR检测。人GAPDH上游5’-ACAACTTTGGTATCGTGGA-3’，下游3’-GCCATCACGCCACAGTTTC-5’；人FOXM1上游5’-AAGAACTCCATCCGCCACA-3’，下游3’-GCTTAAACACCTGGTCCAA-5’；人CDC25B上游5’-TCAAATATCAGTTACCCAC-3’，下游3’-TCCATCCGCAACAAGACA-5’；人survivin上游5’-AACCAGACCCTCATGGCTG-3’，下游3’-TTCCCAGACTCCACTCCAA-5’;人cyclin B1上游5’-GTTGGTTTCTGCTGGGTG-3’，下游3’-ATGTTGATCTTCGCCTT-5’。所有引物均由美国invitrogin公司合成。PCR反应平台采用美国罗氏公司LightCycler®480Ⅱ，参数：95 ℃ 30 s×1个循环，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s×40个循环。反应结束后确认qRT-PCR的扩增曲线和溶解曲线，并进行数据分析。

(6)蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测FOXM1蛋白的表达水平:细胞离心漂洗后，加入RIPA细胞蛋白裂解液，离心取上清，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒计算各组标本的蛋白质浓度。以12% SDS-PAGE凝胶先恒压60 V使蛋白质跑至同一条起跑线上，待跑至分离胶上时，改为90 V，使溴酚蓝全部跑出时停止。电泳结束后，开始转膜，转膜的条件为恒流220 mA、2 h，转膜结束后，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜；次日一抗回收并清洗后，使用HRP标记二抗孵育1 h。经发光剂显影成像，进行图片扫描。

结 果

1.H446和H446/DDP细胞存活率及FOXM1基因mRNA、蛋白表达水平比较：DDP浓度越高，H446和H446/DDP细胞存活率越低。当DDP浓度为4、8、16 μM时，H446/DDP细胞存活率高于H446细胞(P<0.05或P<0.01)；当DDP浓度达到8 μM时，H446/DDP细胞存活率仍高于50%[(53.82±3.39)%]，而H446细胞存活率仅为(25.17±5.04)%，见图1。H446/DDP细胞FOXM1基因mRNA、蛋白表达水平均高于H446细胞(2.34±0.11比1.10±0.03，P<0.01；1.49±0.06比1.02±0.09，P<0.01)。

注：与H446细胞比较，aP<0.05，bP<0.01

2.转染不同载体H446细胞FOXM1基因mRNA和蛋白表达水平比较及转染不同载体H446/DDP细胞存活率比较：FOXM1过表达载体转染H446细胞FOXM1基因mRNA和蛋白表达水平均高于转染空白载体H446细胞(5.84±1.06比1.00±0.10，P<0.01；2.98±0.46比1.00±0.11，P<0.01)。FOXM1过表达载体转染H446/DDP细胞存活率低于转染空白载体H446/DDP细胞[(48.58±6.47)%比(75.95±4.62)%，P<0.01]。

3.不同组别细胞FOXM1基因mRNA和蛋白表达水平、存活率及FOXM1下游基因CDC25B、survivin和cyclin B1 mRNA表达水平比较：H446-siFOXM1组FOXM1基因mRNA和蛋白表达水平低于H446-NC组，细胞存活率高于H446-NC组(P<0.01)；H446/DDP-siFOXM1组FOXM1基因mRNA和蛋白表达水平低于H446/DDP-NC组，细胞存活率高于H446/DDP-NC组(P<0.01)。H446/DDP-NC组CDC25B、survivin和cyclin B1 mRNA表达水平均高于H446-NC组(P<0.01)；H446/DDP-siFOXM1组CDC25B、survivin和cyclin B1 mRNA表达水平均高于H446-siFOXM1组(P<0.01)。见表1。

表1 不同组别细胞FOXM1基因mRNA和蛋白表达水平、存活率及FOXM1下游基因CDC25B、survivin和cyclin B1 mRNA表达水平比较

讨 论

传统上，按照美国退伍军人协会制定的标准，SCLC可分为局限期和广泛期[10]。美国癌症联合会(AJCC)的TNM系统更适合于筛选出适合手术治疗的SCLC患者。但无论根据哪种分期方法，仅无纵隔和锁骨上淋巴结转移的TNM分期Ⅰ期的局限期患者有可能可接受手术治疗。而没有手术机会的广泛期患者约占所有新诊断的SCLC的65%，其治疗方案选择非常有限。根据美国国立综合癌症网络(NCCN)临床实践指南:小细胞肺癌(2022.V2)及中国临床肿瘤学会小细胞肺癌诊疗指南2022，以铂类药物为基础的双药化疗联合免疫治疗方案是广泛期患者的一线治疗方案[11-12]。二线治疗方面，日本的一项研究显示，由顺铂、依托泊苷、伊立替康3种药物组成的联合化疗较伊立替康单药化疗患者的总生存期(OS)有所延长(18.2个月比12.5个月,P=0.007 9)[13]。针对细胞毒性T淋巴细胞抗原(CTLA)-4或程序性死亡受体-配体1(PD-L1)免疫治疗和靶向Delta样经典 Notch 配体 3(DLL3)、血管内皮生长因子(VEGF)等小分子激酶抑制剂也取得了一些进展[14-16]。程序性死亡受体-1(PD-1)/PD-L1单克隆抗体的成功临床试验为恶性肿瘤免疫学开辟了新的途径。Paz-Ares等[17]的一项随机、对照、开放的3期临床研究结果显示，Durvalumab+顺铂/卡铂+依托泊苷显著改善了广泛期SCLC患者的OS。虽然免疫治疗已跻居SCLC治疗的一线方案，但以含铂类药物为基础的双药联合化疗方案仍是SCLC治疗的重要手段，其位置不可替代。

顺铂是SCLC最广泛使用的抗肿瘤细胞的化疗药物。含顺铂的化疗方案可显著延长患者的OS。大部分SCLC患者经初始治疗可获得疾病缓解或控制，但多数患者在4～6个周期后出现疾病进展，意味着肺癌细胞对化疗药物出现耐药，而二线治疗效果很差。因此，研究SCLC化疗耐药的机制，探索其中发挥关键作用的靶点，可能有助于开发逆转SCLC化疗耐药的治疗策略，也有助于制定个体化的治疗方案，从而提高疗效并最大程度减少不良反应。既往研究结果显示，促使SCLC化疗耐药的主要机制包括DNA损伤修复异常(DDR)、细胞自噬异常等[18]。FOXM1是在DDR过程中起关键作用的转录因子，其可通过转录活化DNA聚合酶，PolE2、复制因子C4(RFC4)，并作为DNA连接酶Ⅲ的共作用因子参与DNA碱基切除修复、同源重组、DNA连接等多种DDR过程[19]。FOXM1通过直接调控G1/S和G2/M进展所必需的转录信号网络，在细胞增殖中发挥关键作用，特别是对细胞周期基因的积极调控[20]。下调FOXM1基因表达显著改善卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)对顺铂的耐药性[19,21]。除此之外，FOXM1还参与恶性肿瘤的血管形成、远处转移等多个重要环节，并与多种恶性肿瘤患者的预后明显相关[22-24]。SCLC组织中同样出现FOXM1表达水平明显升高，并与患者的不良预后相关，包括生存期和化疗耐药性。Liang等[20]发现，与低FOXM1表达组相比，高FOXM1表达组SCLC与晚期临床分期、胸外转移及OS降低显著相关(7.90个月比12.46个月)。此外，高FOXM1表达组在标准化疗后的无进展生存期更短(3.90个月比8.69个月)。Liu等[25]的研究证实，FOXM1过表达可降低NSCLC对顺铂的敏感性，而FOXM1表达下调可使对顺铂耐药的NSCLC细胞对顺铂诱导的细胞凋亡敏感，表明过表达FOXM1与NSCLC中顺铂耐药性有关。

Tian等[9]的研究结果显示，染料木黄酮可通过抑制FOXM1通路的过度活化发挥对SCLC的抗肿瘤作用，上调SCLCH446细胞FOXM1表达水平，H446细胞可出现对Genistein耐药，表明FOXM1可介导SCLC对化疗药物的耐药过程。提示FOXM1有可能在SCLC顺铂耐药中发挥重要作用。本研究通过对顺铂耐药的SCLC细胞系H446/DDP的研究发现，与顺铂敏感的H446细胞相比，H446/DDP细胞中FOXM1基因mRNA和蛋白的表达水平均显著增加；而抑制H446/DDP细胞中FOXM1表达，则可显著抑制其对顺铂的耐药性。上调FOXM1表达水平则可使化疗敏感的SCLC细胞出现耐药，表明FOXM1是SCLC顺铂耐药过程中的关键环节。

事实上，FOXM1是调控细胞增殖和凋亡的重要转录因子，在细胞从G1期向S期进化和维持染色体稳定性方面起关键作用。FOXM1通过激活其靶基因CDC25A、CDC25B、cyclinB1、cyclinD1、PLK1及抑制p21、p27等的表达调控细胞周期进展，促进恶性肿瘤的发生[26]。Nestal de Moraes等[27]发现，survivin是FOXM1的直接转录靶标，在乳腺癌耐药细胞系中，FOXM1和survivin的表达明显上调，将FOXM1基因敲除后会导致survivin的表达下降，表明FOXM1可能直接调控survivin参与恶性肿瘤的耐药[27]，与本研究结果一致。Kongsema等[28]研究发现，硫链丝菌素可显著抑制乳腺癌细胞生长，并可明显降低FOXM1及cyclin B1的表达水平，这一效应存在明显的药物浓度依赖性，提示靶向FOXM1/cyclin B1通路可能发挥抗肿瘤作用。综合以上研究结果，推测FOXM1具有成为逆转肿瘤化疗耐药治疗靶点的巨大潜力。同时，本研究也存在一些不足之处，针对FOXM1介导SCLC顺铂耐药的机制，本研究发现顺铂耐药细胞株中CDC25B、survivin和cyclin B1表达水平显著升高，提示这些下游信号可能与FOXM1介导SCLC顺铂耐药有关，与上述研究报道一致，但未能进一步阐明其具体作用及其与DDR异常的关系。这些问题将在今后的研究中进一步探讨。

综上所述，FOXM1基因在SCLC顺铂耐药细胞中表达显著上调，且通过正向调控其下游靶向基因介导细胞的耐药，表明FOXM1是SCLC顺铂耐药过程中的关键环节，可为开发新的SCLC治疗方案提供新靶点和方向。