UPLC-MS/MS直接进样法测定茶饮料中的吡虫啉和乐果残留

吕志强，周文礼

许昌市食品药品检验检测中心，河南 许昌 461000

“开门七件事，柴米油盐酱醋茶”，茶既是大雅之堂的殿上贡品，亦是寻常百姓的餐桌饮品。然而，茶作为一种农产品，在种植过程中为防治虫害，提高产量，不免使用多种农药；同时，颇受消费者青睐的茶饮料作为茶叶的深加工产品，一般以茶叶的水提取液、浓缩液或茶粉为原料加工而成，因此，农药残留是一个不可避免的问题。残留的农药通过食物链的富集作用转移到人体，对人体健康造成危害，因此，研究建立茶饮料中农药残留的检测方法十分必要。

农残的检测方法主要有气质联用技术（GCMS/MS） 和液质联用技术（LC-MS/MS）。GC-MS/MS 因分离效果好，对组分复杂的样品能够实现有效分离，因此广泛应用于农残检测领域，但其对样品前处理要求较高，分析时间较长，效率低；而LC-MS/MS 具有灵敏度高，专属性强，高通量，效率高，在分离不完全的状态下也可以实现对目标分析物的定性定量等特点。目前，应用LC-MS/MS 测定茶饮料中农残的研究鲜有报道，而对茶叶中农残的研究有较多文献报道，且其前处理方法为固相萃取法、液-液萃取法和QuEChERs 法等，这些前处理方法使用了多种有机试剂，成本高、耗时长、操作繁琐。因吡虫啉和乐果为茶园中比较常用的农药，在茶汤中的浸出率也较高，分别可达77.3%和80.5%，故本研究以吡虫啉和乐果为分析目标物，旨在运用UPLC-MS/MS，并尝试将样品过滤后直接进样检测，研究建立一种便捷、准确、高效、经济的适用于茶饮料中吡虫啉和乐果残留的检测方法，以期为茶饮料的质量安全评价提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

UPLC-MS/MS（美国，Waters，UPLC-Xevo TQD)；UPT-I-510T超纯水机（成都优普）；NGM-2000A氮气发生器（北京，LAB PRECITION）。

1.2 试剂与材料

甲醇（德国AppliChem，色谱纯)；乙腈（德国AppliChem，色谱纯)；甲酸（天津科密欧，色谱纯）；超纯水（由UPT-I-510T 超纯水机制备）；高纯氩气（纯度≥99.999%）；微孔滤膜（尼龙，0.22µm）；吡虫啉、乐果标准溶液（坛墨质检，质量浓度均为100µg/mL）；经检测不含乐果、吡虫啉的市售绿茶饮料（GT样）、红茶饮料（BT样）。

1.3 试验方法

精密量取吡虫啉、乐果标准溶液各1.00 mL置100 mL容量瓶中，加乙腈稀释定容，摇匀即得质量浓度为1 000µg/L混标I，分别用GT样和BT样将混标I逐级稀释得到质量浓度分别为2µg/L、5µg/L、10µg/L、20µg/L、50µg/L、100µg/L、200µg/L、500µg/L的系列基质标准工作溶液。

质谱调谐液：用纯乙腈将混标I 稀释至100 µg/L。

稀释剂考察样品：分别用超纯水、10%乙腈、50%乙腈、乙腈、GT样和BT样将混标I稀释至50µg/L。

直接进样法可行性考察样品：用BT样将混标I 稀释至100µg/L（BT 样#）；再用乙腈将BT 样#分别稀释至10µg/L、20µg/L、50µg/L。

基质效应评价样品：分别用10%乙腈、GT 样和BT 样将混标I 分别稀释至5 µg/L、50 µg/L、200µg/L。

方法检出限（MDL）和方法定量限（MQL）样品：分别用GT 样和BT 样将混标I 逐级稀释，具体稀释倍数根据信噪比（S/N）确定，以S/N≥3时的质量浓度作为MDL，以S/N≥10 时的质量浓度作为MQL。

加标回收率样品：分别用GT 样和BT 样将混标I 分别稀释至10 µg/L、50 µg/L、100 µg/L，每个质量浓度水平设3个平行样。

流动相：A 为含0.1%甲酸的超纯水，B 为乙腈，梯度洗脱程序：0～1.5 min，70.0%A；1.5～3.5 min，10.0%A；3.5～4.5 min，10.0%A；4.5～4.6 min，70.0%A；4.6～6.0 min，70.0%A；流速0.250 mL/min；柱温35.0 ℃；色谱柱：UHPAQ C（Agela Technologies，2.1 mm×100.0 mm，1.9 μm）；进样量：5.00 μL。

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描模式；检测方式：多反应监测模式（MRM）；毛细管电压：3.5 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：500 ℃；脱溶剂气氮气流速：1 000 L/h；碰撞气为氩气；目标分析物的其他质谱采集参数见表1。

将上述样品经0.22 µm 滤膜过滤后直接导入UPLC-MS/MS 测定，由MssLynx 工作站软件分析数据，绘制标准曲线，计算样品中各农残的含量。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

吸取1.3.2 项下的质谱调谐液适量，在combined 模式下与流动相（A∶B=50∶50，流速0.200 mL/min）混合后注入质谱仪，通过调整毛细管电压、锥孔电压找到母离子，运用Intellistart自动优化功能，得到最优的锥孔电压和碰撞能，确定定性离子对和定量离子对（表1）。

表1 质谱参数

2.2 稀释剂的选择

研究发现，稀释剂对目标分析物的峰型和分离度影响较大。当稀释剂为乙腈时，吡虫啉和乐果未能有效分离且不成峰，当提高稀释剂中水相的比例时，其峰型不仅变得尖锐，对称性良好，且分离度也有了很大改善。因此，本研究分别以乙腈、50%乙腈、10%乙腈、超纯水、BT样和GT样为稀释剂制备50µg/L标准工作溶液进行考察，结果发现，以10%乙腈、纯水、GT 样和BT 样为稀释剂时，均可得到较为满意的结果（图1）。

图1 6种稀释剂制备的50µg/L标准工作溶液的总离子流图

2.3 色谱条件的优化

以0.1%甲酸为流动相A，乙腈为流动相B 梯度洗脱，考察了3 种色谱柱（ACQUITY UPLCBEH C，1.7 μm，2.1×50 mm；ACQUITY UPLCBEH C，1.7 μm，2.1×100.0 mm；UHP AQ C，1.9 μm，2.1 mm×100.0 mm），不同流动相初始比例（A∶B=90∶10；A∶B=80∶20；A∶B=70∶30；A∶B=50∶50）和不同流速（0.200 mL/min、0.250 mL/min、0.300 mL/min）对分析结果的影响。通过多次反复试验，最终确定色谱柱UHP AQ C，1.9 μm，2.1 mm×100.0 mm的适用性最优，流速为0.250 mL/min，流动相初始比例为A∶B=70∶30，在此色谱条件下系统压力适中。由图2可知，目标分析物的峰型尖锐，分离度较好，保留时间适中，吡虫啉和乐果保留时间分别为2.03 min和2.25 min。

图2 100µg/L标准工作溶液的总离子流图

2.4 直接进样法可行性试验

目前，未见有文献报道运用UPLC-MS/MS 直接进样法测定茶饮料中的吡虫啉和乐果，为验证该方法的可行性，本研究将1.3.2 项下的直接进样法可行性考察样品经0.22µm滤膜过滤后直接进样测定，以目标分析物检测结果的准确度为评判依据，结果见表2。由测定结果可知，茶饮料样品经滤膜过滤后稀释不同倍数直接进样所测结果的准确度在95.5%～107.0%之间，故直接进样法是可行的。

表2 直接进样法测定结果

2.5 基质效应评价[28-29]

因茶汤本身基质复杂，含有多种色素、茶多酚、咖啡碱、有机酸等物质，且茶饮料中会添加糖、食用香精等成分，这些成分是否影响目标分析物的离子响应强度及分析方法的准确性还是未知，因此，本研究考察了吡虫啉和乐果3个质量浓度水平在GT和BT两种基质中的基质效应。以绝对基质效应（AME）为评判依据，计算公式如下：

式中：为基质标准工作溶液峰面积；为溶剂标准工作溶液峰面积；当|AME-1|≤20%时，判定该基质无基质效应；若20%＜|AME-1|＜50%，则为中等基质效应；|AME-1|≥50%，则为强基质效应。由表3可知，吡虫啉在BT 基质中有较强的基质效应，而在GT 基质中无基质效应；乐果在GT 和BT 基质中均无基质效应。为消除基质效应的影响，在配置标准曲线工作溶液时统一选择空白的GT样和BT样为稀释剂。

表3 基质效应评价结果

2.6 线性范围、MDL、MQL

按照1.3.1 项下的方法制备系列基质混合标准工作溶液，以各目标分析物的峰面积为纵坐标，相应的质量浓度为横坐标，考察其线性关系，以S/N≥3 和10 时对应的质量浓度为MDL 和MQL，结果见表4。

表4 标准曲线回归方程

两种基质下吡虫啉和乐果在2～500µg/L范围内线性关系良好，R为0.996 5～0.999 5，MDL为0.010 0～0.033 3µg/L，MQL为0.020 0～0.100 0µg/L，表明该方法可满足检测需求。

2.7 方法精密度

将质量浓度为50µg/L的基质混合标准工作溶液重复测定6 次，计算检测结果相对标准偏差（RSD）。由表5可见，两种基质下吡虫啉和乐果测定值的RSD在0.937%～2.020%之间，表明该方法精密度良好。

表5 方法精密度试验结果

2.8 方法准确度

将1.3.4项下制备好的加标回收率样品过0.22µm滤膜后直接进样测定，每个质量浓度水平设3个平行样，计算平均回收率及RSD。由表6可知，2种基质3个添加水平下吡虫啉和乐果的平均加标回收率在93.3%～111.0%之间，RSD 在0.564%～6.190%之间，可满足分析要求。

表6 加标回收率试验结果

3 结论

本研究尝试采用将茶饮料经0.22µm滤膜过滤后直接进样检测的前处理方法，结合UPLC-MS/MS技术，建立了茶饮料中吡虫啉和乐果快速、准确的检测方法，这在现有文献中还未见报道。通过评价基质效应确定以基质匹配标准工作曲线法定量，并对质谱条件、液相色谱条件、稀释剂等进行了优化。研究结果表明，在绿茶和红茶两种基质中，吡虫啉和乐果在2～500µg/L范围内线性关系良好，相关系数R为0.996 5～0.999 5；MDL为0.010 0～0.033 3µg/L，MQL为0.020 0～0.100 0µg/L；方法精密度良好，RSD （n=6） 在0.937%～2.020%之间；3个质量浓度添加水平下吡虫啉和乐果的平均加标回收率在93.3%～111.0%之间，RSD（n=3）在0.564%～6.190%之间，能够满足农残检测的要求。与现有国家标准和文献报道的方法相比较，该方法避免使用多种有机试剂，成本低、简便高效、精密度好、准确度高，适用于茶饮料中吡虫啉和乐果残留的定性定量分析，为茶饮料的质量安全评价提供了新的参考。