一起仔猪腹泻病的病原学诊断

沈思思

（黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

仔猪腹泻是仔猪常见疾病，病因复杂，可由细菌病和病毒病引起[1]。细菌病主要包括大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌等；病毒病主要包括猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）、猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）和猪轮状病毒（Porcine rotavirus, PoRV）等。这些疾病临床症状相似，需结合实验室诊断才能确诊[2]。

近期齐齐哈尔市某猪场送检3只病死仔猪。该猪场存栏量为850头，此前免疫过猪瘟疫苗、猪呼吸与繁殖障碍疫苗、猪伪狂犬疫苗和猪细小病毒疫苗。此次仔猪腹泻发病猪为5～9日龄，临床症状表现为精神不振、食欲减退、迅速消瘦、排黄绿色稀便并伴有呕吐现象。该疾病在猪场迅速蔓延，仔猪发病率为95 %，死亡率达到30 %。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病理剖检及病料采集 对3只病死仔猪进行剖检并采集20份发病仔猪肛拭子。

1.1.2 主要试剂与仪器 DNA、RNA试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；cDNA反转录试剂盒、DNA MarkerⅡ、Taq酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；离心机（TGL-16G）购自上海安亭科学仪器厂产品；PCR仪（S1000）购自美国伯乐公司；凝胶成像仪（WD-9413B）购自北京六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 病原分离培养 在无菌条件下，用接种环在肠道壁少量蘸取，在麦康凯培养基上划线接种，37 ℃ 培养箱过夜培养。

1.2.2 镜检 将长出的单个菌落进行划线传代，37 ℃ 培养箱过夜培养。将传代后的单个菌落进行革兰氏染色镜检。

1.2.3 DNA提取 将镜检过的同一单个菌落用DNA试剂盒提取DNA。

1.2.4 黏附素毒力基因检测 根据参考文献[3]，合成相关的毒力基因进行PCR扩增，毒力基因引物序列如表1。

1.2.5 病毒性诊断方法 （1）病料处理及RNA提取：将采集的20份肛拭子用PDS处理后，4 000 r离心5 min取上清。将上清液用RNA提取试剂盒提取RNA。（2）cDNA合成及PCR扩增：用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。根据参考文献[4-5]，用PEDV、TGEV、PDCoV和GARV引物分别对20份备检样本进行PCR扩增，引物序列见表2。反应体系：cDNA 2.0 μl，2×Taq PCR Master Mix12.5 μl，上、下游引物1.0 μl，ddH2O 8.5 μl，总体积25 μl。PCR扩增条件：95 ℃ 30 s、55 ℃ 30s，72 ℃ 40s，循环30次，72 ℃ 10 min。取扩增产物5 μl在1 % 琼脂糖凝胶板上点样，电泳15 min，凝胶成像仪上观察结果。送生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.6 药敏试验 根据CLSI指导进行，将细菌培养到1.5× 108CFU/ml，用接种环均匀划线在培养基上，将药敏片按顺序放置在平板上，37 ℃培养箱过夜培养。

2 结果

2.1 剖检结果

3只病死仔猪剖检均表现为肠壁薄而透明，肠腔内积聚黄色液体和气体，肠壁有出血并伴有水肿现象，胃里有未消化的凝乳块，见图1。

图1 仔猪剖检

2.2 细菌学诊断结果

麦康凯培养基上长出粉红色小菌落，纯化后，显微镜下观察看到革兰氏阴性短小杆菌，散在分布，可以确定为大肠杆菌，见图2。毒力基因结果发现，该细菌是K99毒力基因，为产肠毒素大肠杆菌（ETEC）。20份样本中检出15份大肠杆菌阳性，见图3。

图2 大肠杆菌镜检图

图3 大肠杆菌K99 PCR扩增图

2.3 病毒学诊断结果

PCR结果见图4，20份样本中只检出PEDV阳性样本12份。TGEV、PDCoV和PoRV均为阴性。PEDV与Bank登录序列AF353511同源性为99 %。

图4 PEDV PCR扩增图

2.4 药敏试验结果

药敏结果显示该株细菌对环丙沙星和丁胺卡那敏感，对林可霉素、氨苄西林、头孢唑林、土霉素、庆大霉素、四环素和青霉素耐药。

3 讨论

PEDV造成的仔猪腹泻与TGEV、PDCoV和PoRV临床症状和病理剖检相似，如需确认需结合PCR检测。PEDV会造成机体免疫力下降，从而易感染大肠杆菌。大肠杆菌是肠道正常菌群之一，但是在特定条件下可以致病，本试验通过细菌分离培养和染色镜检诊断为大肠杆菌，结合毒力基因检测确定其为K99产肠毒素大肠杆菌，对机体有致病性。该猪场是PEDV和产肠毒素大肠杆菌的混合感染，导致仔猪大量死亡，造成了巨大的经济损失。

PEDV应以预防为主，按时接种疫苗。为防止进一步的疾病扩散，应对猪舍进行彻底的清洁消毒，PEDV和大肠杆菌一般会随着猪的排泄物排出，污染饲料和水源等，还会通过气溶胶传播，所以应将污染物及时焚毁，并将患病猪进行隔离，控制好传染源，是阻止疾病传播的第一步。仔猪腹泻易发生在寒冷季节，因此也要做好猪舍的保暖工作。

4 结论

该猪场病毒与细菌的PCR检测结果表明该猪场由PEDV和致病性K99产肠毒素大肠杆菌混合感染所致。20份肛拭子检测结果为PEDV样本总阳性率为12/20，大肠杆菌样本总阳性率为15/20，其中PEDV与大肠杆菌混合感染阳性率为12/15，TGEV、PDCoV和PoRV未检出。药敏结果显示该菌株对环丙沙星和丁胺卡那敏感。经环丙沙星治疗，病情得到初步控制。