超高效液相色谱-串联质谱法同时测定吊瓜中3种农药残留量的研究

高 迪，胡楚娇，龙家寰，魏 进，张 盈，段婷婷*

(1.贵州省农业科学院植物保护研究所，贵州 贵阳 550006；2.贵州医科大学医药卫生管理学院，贵州 贵阳 550006)

吊瓜(TrivhosantneskirilouiiManim)，别名栝楼、瓜蒌等，葫芦科栝楼属植物，多年生攀援草木，雌雄异株，分布于我国辽宁、华东、华北、西南等地区[1]。《本草纲目》中有记载“瓜蒌仁，润肺燥、降火、治咳嗽、利咽喉、止清渴”，无特殊味道，食用方式多样。吊瓜仁富含脂肪油、三萜皂苷和蛋白质等物质，具有优良的保健与食用功能，因此吊瓜已经成为市面上“药食同源”的休闲食品新选择[2]。伴随着吊瓜田间种植面积的扩大，其病虫害问题日益凸显出来。当前吊瓜上的主要病虫害有：根结线虫病、炭疽病、病毒病、透翅蛾、菱斑食植瓢虫和瓜藤天牛等[3-4]，目前并没有在吊瓜上登记的农药，经过文献查询并结合实地走访发现，吊瓜病虫害的防治药剂主要是烯酰吗啉、敌敌畏、乙基多杀菌素、三唑酮和戊唑醇等[5]，参照农业部明令禁止使用的农药名单[6]，本试验选取烯酰吗啉、乙基多杀菌素和戊唑醇进行研究。

目前，关于烯酰吗啉、乙基多杀菌素和戊唑醇在常见农副产品上的残留检测多有相关报道，如草莓、葡萄、猕猴桃和辣椒等[7-10]，同时随着这3种药剂的使用范围扩大，其在中药材上的农药残留问题也逐渐得到重视，如三七、枸杞、人参等[11-13]。常见的检测方法有液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)等，当前尚未见能同时检测吊瓜上烯酰吗啉、乙基多杀菌素和戊唑醇的试验方法。由于吊瓜富含油脂和色素，基质成分较复杂，现有的检测方法无法满足吊瓜上的农药残留检测条件，因此本试验建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时检测烯酰吗啉、乙基多杀菌素和戊唑醇3种农药在吊瓜上的残留检测方法；同时在贵州省息烽县九庄镇吊瓜种植基地进行农药残留田间试验，对试验后的吊瓜样品进行农药残留检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS，UItimate 3000/TSQ Vantage)，美国Thermo Fisher公司)；Hypersil GOLD C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，2.1 μm，美国Thermos Fisher公司)；CK 200型高通量组织研磨器(北京托摩根生物有限公司)；电子分析天平(精度0.0001 g，德国sartorius公司)，XW-80A 涡旋仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；TG 16-Ⅱ 离心机(湖南平凡科技有限公司)。

烯酰吗啉标准品(纯度99.7%，北京勤诚亦信科技开发有限公司)；乙基多杀菌素标准品(纯度94.2%，北京勤诚亦信科技开发有限公司)；戊唑醇标准品(纯度98.8%，北京勤诚亦信科技开发有限公司)；乙腈(分析纯，天津市欧米克公司)、氯化钠(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)；甲酸(分析纯，天津市欧米克公司)；无水硫酸镁(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，德国默克公司)；无水乙酸(色谱纯，天津市光复科技发展有限公司)； PSA、GCB [安捷伦科技(中国)有限公司];0.22 μm有机系滤膜(日本岛津公司)。

吊瓜样品采自贵州息烽九庄镇吊瓜基地，试验按照1.4节进行。

1.2 样品前处理

称取5.0 g均质吊瓜瓜子仁于50 mL塑料离心管，加入10 mL含1%乙酸的乙腈溶液和10 mL蒸馏水，涡旋振荡15 min，加入4.0 g无水MgSO4、2.0 g NaCl混匀，涡旋振荡5 min后于5000 r/min条件下离心5 min，移取1.5 mL上清液于装有10 mg GCB、100 mg PSA、和150 mg无水MgSO4的2 mL离心管中，涡旋1 min，离心5 min，取上清液过0.22 μm的有机系滤膜，待测。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18色谱柱，100 mm×2.1 mm，2.1 μm，流动相及梯度洗脱条件见表1。柱温∶40 ℃；进样量∶5 μL，自动进样器进样；进样盘温度∶10 ℃。

表1 流动相及梯度洗脱条件

1.3.2 质谱条件

电离源模式：电喷雾离子化(ESI)；离子源极性∶烯酰吗啉、乙基多杀菌素、戊唑醇均为ESI+；雾化气：氮气；鞘气流速：35 arb，辅助气流速：10 arb；喷雾电压：3 200 V；毛细管温度：350 ℃；离子传输管温度：330 ℃。3种农药具体保留时间、检测离子对、锥孔电压和碰撞能量表等参数见表2。

表2 3种农药的质谱参数

1.4 田间试验样品残留检测

参照NY/T 788-2018《农作物中农药残留试验准则》，于2020年8月下旬在贵州省贵阳市息烽县九庄镇吊瓜种植基地进行烯酰吗啉、乙基多杀菌素和戊唑醇在吊瓜上的残留试验，吊瓜品种为越蒌3号。选取合适的种植地，将4株划分为一个小区，共计8个小区，在6个小区各喷施20%烯酰吗啉悬浮剂(900倍液)、60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂(30 mL/667m2)和430 g/L戊唑醇悬浮剂(17 mL/667m2)各一次，每个药剂设置2个平行，剩余2个小区设置为空白对照。待吊瓜成熟后，于收获期采样，按照1.2节的前处理方式和1.3节的仪器条件进行3种农药的残留检测。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择

在残留检测常用的提取剂有丙酮、甲醇和乙腈等，其中液相色谱法常用的提取剂以乙腈为主，而加入少量冰乙酸能使整体提取液偏弱酸性，提高烯酰吗啉和戊唑醇的稳定性，同时降低提取的杂质，因此本试验选择了1%冰乙酸乙腈作为提取剂。

目前常用的样品净化剂有PSA、GCB，主要用于去除样品中的油脂和色素等杂质，这恰好是吊瓜样品中最主要的两种杂质，而无水MgSO4则常用于去除样品中的水分，因此本试验将选择PSA和GCB作为净化剂。为了验证其净化效果，本试验尝试了3种净化剂：净化剂1 (100 mg PSA+150 mg无水MgSO4)、净化剂2 (100 mg PSA+10 mg GCB)、净化剂3 (100 mg PSA+150 mg无水MgSO4+10 mg GCB)。对空白样品中进行添加水平为0.1 mg/kg的回收率检测试验(如表3)。结果发现，使用净化剂1进行前处理时，乙基多杀菌素(-L)的回收率约为121%，使用净化剂2进行前处理时，烯酰吗啉的回收率约为68%，使用净化剂3时，3种农药的回收率均在80%～105%之间，符合NY/T 788-2018标准要求的回收率和相对标准偏差(RSD)，因此将使用净化剂3(100 mg PSA+150 mg无水MgSO4+10 mg GCB)对后续试验进行样品前处理。

表3 3种净化剂对3种农药的平均添加回收率和相对标准偏差

2.2 线性范围及基质效应

中国、日本、美国、欧盟、CAC等国家和机构暂没有制定吊瓜上关于烯酰吗啉、乙基多杀菌素和戊唑醇的农药残留最大限量(MRL)，根据欧盟规定的暂无MRL值的参考值(0.01 mg/kg)，本试验将0.01 mg/kg作为参考MRL，分别配置0.001、0.005、0.01、0.05和0.1 mg/L等5个浓度的溶剂标溶液和基质标溶液，其中基质为空白样品最终净化的溶液。经过UPLC-MS/MS检测后，分别以峰面积和浓度为纵坐标和横坐标，拟合标准曲线，统计得到对应的线性回归方程(表4)。结果表明，在0.001～0.1 mg/L的线性范围内，3种农药的线性关系良好，同时相关系数均大于0.99，故此条件能满足检测要求。

表4 3种农药的线性范围、线性方程、相关系数

质谱检测中经常出现基质增强或减弱的基质效应，为提高检测结果准确性，一般都会采用基质匹配标准曲线斜率和溶剂标准曲线斜率之比(K)来评价基质效应[12]。结果表明，3种农药在吊瓜仁中基质效应在0.54～0.64之间，表现为中等基质抑制效应，为减少基质效应对检测结果的影响，后续试验将采用基质标曲线进行药剂定量分析。

2.3 准确度与精密度

分别在空白吊瓜样品中设置4个添加水平0.001、0.01、0.05和0.1 mg/kg的烯酰吗啉、乙基多杀菌素、戊唑醇，每个添加水平5次重复。使用1.2节的前处理方式和1.3节的仪器条件进行检测，根据检测数据得到相应各浓度的平均回收率和RSD，详细结果如表5。

表5 4个添加水平下3种农药的平均添加回收率和相对标准偏差

结果表明，检测结果均符合NY/T 788-2018标准要求的回收率和RSD。因此烯酰吗啉、乙基多杀菌素和戊唑醇3种农药的最低添加浓度即为其对应的定量限(LOQ)和检出限(LOD)，即0.001 mg/kg，低于本试验设定的参考MRL(0.01 mg/kg)，因此本试验建立的检测方法可运用于吊瓜上烯酰吗啉、乙基多杀菌素和戊唑醇的农药残留相关检测。

2.4 实际样品分析

采用本文的试验方法对收获期吊瓜样品进行检测。结果表明，在吊瓜上施用20%烯酰吗啉悬浮剂、60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂和430 g/L戊唑醇悬浮剂后，仅戊唑醇有残留检出，检出量约为0.002 mg/kg，其余两种农药在吊瓜瓜子仁上的残留量均低于LOD(0.001mg/kg)。检测结果证实：上述3种农药在吊瓜上的残留检出量均低于欧盟规定的暂无MRL值的参考值(0.01 mg/kg)。

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时检测吊瓜上烯酰吗啉、乙基多杀菌素和戊唑醇3种农药的检测方法。该方法简便、快速、高效，可广泛运用在吊瓜中农药残留的相关研究中。通过对田间按照推荐剂量施用过20%烯酰吗啉悬浮剂、60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂和430 g/L戊唑醇悬浮剂的吊瓜样品进行残留检测发现，施药后40 d采收的吊瓜瓜子仁农药残留检测均未超过MRL值，可安全采收食用。