黄连根腐病病原菌分离纯化及鉴定

邓思怡，刘 军，常 威，温州权，汪 华*

(1.湖北省农业科学院植保土肥研究所，湖北 武汉 430064；2.华中作物有害生物综合治理重点实验室，湖北 武汉 430064；3.利川市农业技术推广中心，湖北 利川 445400)

黄连(CoptischinensisFranch)又名鸡爪连、川黄连等，是多年生草本植物[1-2]。黄连主要以根茎供药用，由于其具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降糖等药用活性，在医疗及保健等行业得到了广泛应用，黄连种植具有广阔的前景[3]。黄连在我国四川、贵州、湖南、湖北和陕西等省均有栽培，多产于海拔500 m～2000 m之间的山地森林或山谷阴处。湖北省利川市是我国黄连的主要产地之一。有41%的地区是海拔800 m～1200 m的山地，年均温12.3℃，年降雨量1200 mm～1400 mm；海拔1200 m～2000 m的高山面积占比为52%，年均温11.1℃，年降雨量1370 mm，生态环境非常适宜黄连的生长。2011年，利川市获得中国中药协会颁发的“中国生态黄连之乡”称号[4]。利川市黄连种植面积大，品质好，但在其栽培过程中，病害防治是产业上的难点。明确利川黄连重要病害的病原，对其病害防治具有重要意义。本研究对湖北省利川市的黄连样品上的病原进行了分离和纯化，结合形态学和分子生物学等方法对病原进行了鉴定，并通过柯赫氏法则测定其致病性，旨在为黄连病害生产防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021年12月，由利川市农技推广中心温州权站长从湖北省恩施州利川市建南镇采集的根部感病黄连植株，邮寄到实验室进行分离培养。如图1所示，样品叶片干枯，呈紫红色，发黑，根部可以观察到黑褐色病部。

图1 感病的黄连植株

1.2 试验仪器

PDA固体培养基(马铃薯(200 g)煮提液，葡萄糖20 g，琼脂粉15～20 g，水1000 mL)；光学显微镜；植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 病原菌的分离

1.3.1 病样处理

用灭菌剪刀将黄连地上部分剪去，根系以上留下约1 cm。将切下的黄连根系倒置于塑料杯中，根部朝上，并在杯底部加入无菌水，无菌水不宜漫到根部组织，用保鲜膜封上杯口。

图2 感病的黄连根系

图3 感病植株根系密闭培养

1.3.2 病样组织块初步培养

采用组织分离法[5]对黄连病叶及根部的病健交界处进行分离，用无菌手术刀切取0.5～1 cm大小的组织块，用15%双氧水清洗15 s，75%酒精清洗30 s，再用无菌水清洗3次，用灭菌滤纸吸干组织块表面的水分，病部朝上置于PDA培养基中。于室温下平放培养1 d，待表面生长出菌丝后再倒置培养2～3 d。

1.3.3 病样菌丝及菌丝团初步培养

待密闭培养的黄连根部长出菌丝后，用灭菌牙签挑取不同部位的菌丝，接种到PDA培养基中。于室温下平放培养1 d，待表面生长出菌丝后再倒置培养2～3 d。

1.4 分离菌的纯化

用灭菌牙签挑取疑似病原菌进行纯化培养。选取菌落外围的菌丝，接种于PDA培养基中。于室温下倒置培养3～5 d，置于4℃保存。

1.5 分子学鉴定

按照植物基因组DNA提取试剂盒说明书提取病原菌DNA，使用2×PCR Master Mix试剂盒对菌株进行PCR扩增。选用通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[6]进行扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。反应结束后进行1.0%琼脂凝胶电泳检验。PCR产物送公司进行测序。

1.6 致病性测定

选取健康的黄连植株，每组5株，将根部冲洗干净后，在无菌操作台上对其进行灭菌，用75%酒精清洗2～3 s，再用无菌水清洗2～3次，用滤纸吸干表面水分，在浓度为106ofu/mL的孢子悬浮液中浸根30 min，对照组用无菌水浸根。将浸根后的植株栽培在灭菌的培养基质中，10 d后观察黄连的发病情况，并对发病的黄连根部再次进行病原分离和鉴定。

2 结果与分析

2.1 发病症状鉴别

黄连健康植株根系发达，须根亮褐色，叶部嫩绿[7]。黄连根腐病主要危害根部，发病时须根变为黑褐色，干枯。叶面初期从叶尖、叶缘变紫红色不规则病斑，逐渐变暗紫红色。叶背面由黄绿色变紫红色。受害叶呈萎蔫状，后期干枯致死，病株很容易从土中拔起[8]。病样根部有黑褐色部位，叶片紫红色，与黄连根腐病症状相符。

2.2 菌落形态学鉴别

如图4所示，纯化的单菌落菌丝为白色，呈现放射状分布，菌丝后期变为红褐色。培养期间PDA无变色现象。菌落形态学与镰刀菌相符。

图4 分离出的单菌落

2.3 病原菌分子学鉴别

提取的病原DNA，经ITS序列分析，结果为镰刀菌(Fusarium)。

2.4 致病性测定

用孢子悬浮液浸根的黄连植株上的发病症状与田间一致，顶端新叶黄化，须根变黑。对照的无菌水接种则没有出现发病症状。对接种发病的黄连根系再次分离，均能纯化出相同的病原菌。

3 结论

近年来，随着人工种植面积扩大以及连作现象增加，病害的发生已经成为危害黄连产量和质量的重要因素。目前黄连主要病害有根腐病、白绢病、紫纹羽病、叶斑病、白粉病、炭疽病等，以根腐病为害尤甚。四川、湖北等地的调查结果表明，根腐病的常年发病率在40%左右[9]。本研究通过真菌ITS序列分析鉴定病原菌，并结合发病症状、病原菌形态学及致病性测定，确定样品病害为黄连根腐病，其病原菌为镰刀菌(Fusarium)，这为在生产中防治黄连病害提供了理论依据，之后可在此基础上，开展黄连根腐病的致病机理、病原生物学以及防治等方面的研究。