葎草化感活性对白花泡桐种子萌发及幼苗生长的影响*

朱秀红，王明昆，张威，于宏，张雅梅，茹广欣

(1.河南农业大学 林学院,河南 郑州 450002;2.郑州市林业科技示范中心 ，河南 郑州 450002)

化感效应自Rice(1983)[1]和Molisch(1937)[2]等提出以来，经过国内外学者不断完善，其概念得到了进一步的深化和拓展——化感效应即植物通过雨雾淋溶、自然挥发、根系分泌和枯枝落叶分解、植株分解、种子萌发和花粉传播等的方式将自身包含一定信息的化感物质传递出来[3-5]，并对周围植物[6-7]、动物[8]、微生物[9]产生有利或有害的影响。化感作用在作物增产、森林抚育、病虫害防治以及生物复合群落等方面有重要应用。

葎草(Humulusscandens)是桑科(Moraceae)葎草属(HumulusLinn)植物。有研究证实[12]，葎草茎叶挥发物对生菜、萝卜、黄瓜和小麦种子萌发呈现出低促高抑现象，对幼苗生长有明显的抑制作用。由于国内对其开发利用程度不高，其对农民、牧民和林业生产者造成很大困扰，所以被称为恶性杂草。随着葎草的化感效应研究逐渐增加，相关学者希望通过以替代控制策略研究葎草治理喜旱莲子草[10-11]，却忽视了葎草对本土植物的抑制作用和对本地生态环境的负面影响。白花泡桐(Paulowniafortunei)为玄参科(Scrophulariaceae)泡桐属(PaulowniaSieb.et Zucc.)植物，泡桐属花中含有黄酮类、苷类、萜类等次生代谢物质[13]，具有极高的医药开发潜力。白花泡桐叶中含有洋芹素、木犀草素、熊果酸等物质，可制成抗癌抗菌的药品[14-15]。此外，其花、叶中都含有一定量的化感物质，叶片浸提液能明显抑制小麦、玉米、大豆种子发芽率、发芽势，具有一定程度的化感潜力[16]。对于泡桐在不同极端环境下的反应和耐受性[17-19]已有较为深入研究，但是对于其化感物质的耐受能力鲜有报道。

化感物质对于种子萌发的影响将会直接影响植物以后的生长发育[20]，尤其是开展造林活动时，出苗率的高低很大程度上决定了造林成功与否。化感效应受到化感物质浓度、种类的影响，与受体植物物种、发育时期等因素也有不可分割的联系[21-22]。如：赵妹等[23]发现双子叶植物比单子叶植物对于葎草粉末的化感作用更加敏感，叶器官粉末的抑制效果强于其他器官；张震等[11]研究发现葎草地下部分浸提液对喜旱莲子草的化感作用强于地上部分浸提液。此外，如多酚[24]、总黄酮[25]、木犀草素-7-葡萄糖苷[26]、木犀草苷、β-石竹烯[27]等化感物质在不同植物器官中其含量亦各有不同。

杂草对广义上的农业(农林牧副渔)行业发展造成很大程度的影响[28]。葎草作为一种林下常见杂草，就泡桐林抚育而言，杂草泛滥，对林地本身、林业经济或是林下生态都产生一定程度的影响，尤其在林地形成早期，前一年葎草的枯枝与当年生的葎草幼苗均对泡桐林地产生较强的负面影响。因此，研究葎草对于泡桐种子萌发和幼苗生长显得意义颇重。本文以白花泡桐为受体，研究葎草不同器官对泡桐幼苗的化感作用，以期为泡桐林地管理及其幼树更新提供参考。同时，以葎草-泡桐为例，以期深入了解草本植物对木本植物的化感活性关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验葎草取自河南农业大学第三科教园区(113°39′35″ E、 34°47′16″ N，海拔108 m)。2020年10月19日采集野生葎草，先自来水冲洗2～3 遍，至干净无异物即可，再用蒸馏水冲洗表面残留物质，用剪刀分剪各个器官，包括苞片(H)、茎(J)、叶(Y)、种子(Z)，阴干备用。

白花泡桐种子于2020年10月31日采集于河南农业大学科教园区，种源为湖南张家界，采集泡桐果摊开晾晒，待开裂收集种子装在信封中，放于阴凉干燥处备用。

1.2 葎草浸提液制备

将葎草已经分剪好的茎剪成1～2 cm的小段，分别取阴干茎、叶、苞片各30 g浸泡于200 mL蒸馏水中，置于(25±1) ℃恒温摇床中以100 r/min震荡24 h得浸提液，通过定性滤纸抽滤，定容至300 mL，得到浓度为0.1 g/mL的母液，置于4 ℃冰箱备用[29]。

1.3 发芽试验

试验采用培养皿萌发法。取白花泡桐种子用5%的NaClO消毒30 s，用蒸馏水反复冲洗3～4次；将处理好的种子分装至培养皿中，每个培养皿30粒，垫两层滤纸，加蒸馏水浸泡种子至种子保湿而不漂浮为度；置于25 ℃无菌室中培养，光暗时间12/12 h，每天早上10:00向培养皿中加入2 mL的苞片(H)、茎(J)、叶(Y)水浸提液，蒸馏水做空白对照(CK)：稀释母液设置4个浓度梯度，0.100、0.075、0.050、0.025 g/mL 4个浓度梯度，依次标记为H1、H2、H3、H4、J1、J2、J3、J4、Y1、Y2、Y3、Y4，每组3个重复。

葎草种子经清水浸泡筛选，选取籽粒饱满、大小一致的种子按照白花泡桐种子的处理方法消毒。将白花泡桐种子与葎草种子按照10︰0、7︰3、1︰1、3︰7、0︰10(种子总数为50粒，不同的种子比例分别记为Z0、Z1、Z2、Z3、Z4)的比例随机混合于培养皿中，每组重复3次，每皿每天添加2 mL蒸馏水。

每天早上10:00统计发芽数量(粒)，发芽以胚芽长超过种子的1/2为准；发芽数稳定2 d不变视为发芽结束。

发芽率%=最终发芽数量/供试种子总数×100%

发芽势%=7d发芽数量/供试种子总数×100%

发芽指数(粒/d)=∑(Gt/Dt)

式中；Gt为第t天的发芽数量，Dt为对应的发芽时间(d)。

1.4 生化指标测定

发芽试验中种子发芽后于培养皿中继续培养，每天照常添加不同浓度浸提液，14 d后测量茎长、根长、鲜重等3种形态指标。

取新鲜芽0.1 g，采用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶(SOD)含量、采用愈创木酚法[30]测定过氧化物酶(POD)含量。

1.5 化感效应综合评价

化感作用效应指数(Response index，RI)计算方式[31-32]如下：

式中：C为对照值，T为处理值RI为各项指标的化感作用效应指数。

化感综合效应指数(Synthetical allelopathic index，SE)为各项指标RI的平均值[32]。RI>0，SE>0表示促进；RI<0，SE<0表示抑制；绝对值大小表示化感作用强度。

1.6 数据处理

采用EXCEL 2016软件进行数据整理，SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，使用LSD 检验对数据进行多重比较，以及K-means聚类分析，使用Origin 2018绘图，采用字母法标注显著性，不含相同字母则说明具有显著差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 葎草浸提液对白花泡桐的化感作用

2.1.1 对种子萌发的影响

相较于CK，葎草的茎、叶浸提液对白花泡桐种子萌发呈现出高浓度促进，低浓度抑制，苞片浸提液对于种子萌发大体表现为低浓度促进高浓度抑制(图1)；各浓度的茎、叶浸提液都能提高白花泡桐种子的发芽势，表现出低浓度促进高浓度抑制(图2)；葎草茎、叶浸提液都能提高白花泡桐种子的发芽指数，高浓度茎、叶浸提液与CK组相比，能显著提高发芽指数39.71%～82.80%(P<0.05)(图3)；茎浸提液的促进效果随浓度上升先增加后衰弱再增强，叶和苞片浸提液对于发芽指数的影响趋势相同，先升高后降低；但是在0.075、0.100 g/mL时，苞片浸提液显著抑制发芽指数，叶片浸提液则显著提高发芽指数。

图1 白花泡桐种子在不同浓度葎草浸提液处理下的发芽率

图2 白花泡桐种子在不同浓度葎草浸提液处理下的发芽势

图3 白花泡桐种子在不同浓度葎草浸提液处理下的发芽指数

2.1.2 对幼苗生长的影响

白花泡桐幼苗的根长和茎长是葎草浸提液中的化感物质对于泡桐幼苗影响综合的、直观的反映；茎、叶、苞片浸提液都对白花泡桐幼苗根生长产生抑制效果，且效果相近，总体表现为高浓度抑制效果强、低浓度抑制效果弱。J2、Y1、H1泡桐幼苗的根长抑制效果分别在葎草茎、叶、苞片浸提液处理下最强，与CK相比降低92.95%、79.44%、87.27%(P<0.05)；对于幼苗茎生长的影响效果则有所差异，茎浸提液表现为低浓度促进，高浓度抑制；叶片和苞片浸提液对于茎长低浓度促进效果强，高浓度促进效果弱，Y3、H3处理能显著促进茎长达43.05%、61.67%(P<0.05)(图4)。

图4 葎草不同部位浸提液对白花泡桐幼苗根长和茎长的影响

不同浓度的茎浸提液都对白花泡桐幼苗鲜重产生了一定程度的促进作用，随着浓度的下降表现为“降低-升高-降低”的变化趋势，J3处理相比于CK显著增加幼苗鲜重48.15%(P<0.05)；叶浸提液对幼苗鲜重表现为高浓度抑制，低浓度促进，Y2相比与CK显著增重55.56%(P<0.05)；苞片浸提液整体上对白花泡桐幼苗鲜重产生抑制效果，H1抑制效果最强，比CK鲜重显著减少74.07%(P<0.05)(图5)。

图5 葎草不同器官浸提液对白花泡桐幼苗鲜重的影响

超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)是植物体内两种关键的抗氧化酶，普遍存在于植物的细胞中，在清除活性氧过程中起有重要作用，使有机体免受自由基损伤[32]，防止自由基破坏细胞组成、结构和功能，可以增强植物在逆境中的耐受能力[33]。白花泡桐幼苗的SOD活性随着浸提液浓度的降低活性逐渐增强，表现为高浓度抑制，低浓度促进(图6)，Y1、H1组处理比CK的SOD活性显著减少12.68%、22.42%(P<0.05)，Y4组相比于CK组SOD活性显著增强16.69%(P<0.05)。茎浸提液对白花泡桐苗POD活性影响随着浓度的减小呈先上升后下降，但总体活性呈抑制水平(图7)；叶片和苞片浸提液对白花泡桐苗的POD活性影响表现相同：都是高浓度显著抑制，低浓度促进。

图6 葎草不同器官浸提液对白花泡桐幼苗超氧化物歧化酶活性的影响

图7 葎草不同器官浸提液对白花泡桐幼苗过氧化物酶活性的影响

2.2 葎草种子对白花泡桐的影响

2.2.1 葎草种子对泡桐种子萌发影响

本实验Z4组无泡桐种子，各实验数据不包含Z4。Z1、Z2、Z3组的发芽率比Z0显著降低44.45%、54.45%、66.67%(P<0.05)，但各组与Z0组发芽势无显著差异，Z1、Z2比Z0相较增加28.13%、9.38%，Z3相较Z0下降15.61%，各组间发芽指数随着白花泡桐种子：葎草种子比值降低逐渐降低，Z2、Z3相比于Z0发芽指数显著降低29.90%、49.85%(图8)。

图8 不同比例葎草种子对白花泡桐种子萌发的影响

2.2.2 葎草种子对白花泡桐幼苗生长的影响

Z3处理时白花泡桐幼苗茎长最长，Z2处理茎长最短，茎长随着白花泡桐种子：葎草种子的比值减小而先增大后减小；Z0处理根长最长，Z3处理根长最短，白花泡桐幼苗根长随着比值减小而先减小后增大(图9)。

图9 不同比例葎草种子对白花泡桐幼苗茎长和根长的影响

Z0处理鲜重最低，Z1鲜重最大，白花泡桐幼苗鲜重随着比值的减小而先上升后下降，4组处理间无显著差异(图10)。

图10 不同比例葎草种子对白花泡桐幼苗鲜重的影响

白花泡桐幼苗SOD活性随着比值减小先升高后降低，Z2处理SOD活性最强，与其他组具有显著差异(P<0.05)，Z3活性最弱(图11)；白花泡桐幼苗POD活性随着比值的降低而增加，Z0处理POD活性最低，Z3处理POD活性最强，POD活性随着比值的减小而逐渐增大，但四处理间无显著差异(图12)。

图11 不同比例葎草种子对白花泡桐幼苗超氧化物歧化酶活性的影响

图12 不同比例葎草种子对白花泡桐幼苗过氧化物酶活性的影响

2.3 葎草化感活性物质对泡桐的化感综合效应综合评价

在不同处理条件下，茎长、根长、鲜重、发芽率、发芽势、发芽指数、POD、SOD指标的化感效应指数(表1)都受葎草营养器官(茎、叶、苞片)浸提液的影响，都对白花泡桐种子综合化感效应指数呈现出低促高抑现象。单一种子实验中，对茎而言，0.05 g/ml的浸提液对于白花泡桐的萌发和幼苗生长起明显促进作用，0.1 g/mL和0.075 g/mL起轻微的抑制作用；对叶而言，0.1 g/mL的叶浸提液对于白花泡桐的化感效应起轻微的抑制效果，随着浓度的下降，化感效应的促进效果逐渐变强，0.025 g/mL促进效果最好；对苞片而言，高浓度的苞片浸提液(即0.1 g/mL)对泡桐化感作用的抑制效果最强，但在0.025 g/mL仍表现为促进效果；在混合种子实验中，白花泡桐种子和葎草种子共生于相同环境中，随着泡桐种子：葎草种子比例下降，泡桐所受化感作用的促进效果逐渐变弱，抑制效果逐渐变强。

表1 白花泡桐受葎草不同器官的化感效应指数及化感综合效应指数

单一种子实验中，茎浸提液对白花泡桐种子的萌发没有表现出明显的规律，说明茎浸提液中的多种化感物质对种子萌发速度和萌发率产生不同的效果，以至于出现多种化感物质相互拮抗作用；POD对茎浸提液中的化感物质的作用效果十分敏感，遭受了较强的破坏作用，SOD对于化感物质则不太敏感。

0.025 g/mL的叶浸提液对白花种子发芽的影响与传统意义上的“低促高抑”的结果相左，即随着浓度的升高促进作用越强，说明叶片中含有促进种子萌发的化感物质，且该类化感物质对于泡桐种子的发芽表现出一定程度的“剂量效应”；0.100 g/mL的叶浸提液对于SOD和POD的破坏作用强于其他浓度，POD对0.075和0.050 g/mL的叶浸提液的敏感性较强，受到一定程度的破坏，但是SOD对其敏感程度不高，0.025 g/mL时则能促进SOD和POD的活性，所以低浓度的叶片浸提液能加强幼苗的抗逆性，高浓度则会抑制幼苗生长，甚至对幼苗有致死效果。

苞片浸提液中的化感物质对于本文测量的各项指标均表现出低浓度促进，高浓度抑制，或者抑制效果随着浓度的上升而增强，只有SOD活性对苞片浸提液(0.025、0.05、0.075 g/mL)的化感物质表现不敏感，0.075 g/mL的中的化感物质，会抑制POD活性，但却对SOD活性没有明显的影响。

从混合种子实验中可以发现，葎草种子的数量能够对白花泡桐种子萌发和幼苗生长产生一定程度的影响，且随着泡桐比例的减小，泡桐种子的发育繁殖能力就越差，但是种子的影响效果相较于其他器官效果会更差。

2.4 葎草不同器官化感物质对泡桐化感效应强度的聚类分析

利用K-means聚类分析法，分为第一聚类包括J1、J3、J4、Y1、Y2、Y3，除根长和POD活性呈抑制，SOD活性所受影响微弱，大部分指标所受化感效应都呈现出促进作用；第二聚类包括J2、H3、H4、Y4，除根长和发芽率指标以外，其它各项指标所受化感影响都是促进作用，但较第一类影响偏弱；第三聚类包括 Z0，其所受化感作用都不明显，除发芽率、发芽势、SOD活性以外，其余指标在化感作用下皆表现为促进作用；第四聚类包括Z1、Z2、Z3，根长、发芽率、发芽势都受到较强的化感抑制作用，其他各指标均表现为促进作用；第五聚类包括Z4，本组聚类由于无泡桐数据，不予分析；第六聚类包括H1、H2，此组聚类各组数据均表现出明显的化感抑制作用。

聚类分析的结果和综合化感效应指数之和的结果略有出入：按照各器官综合化感效应指数来看，化感作用强度为：苞片>叶片>茎>种子；按照聚类分析结果来看，化感作用强度为：第六聚类(H1、H2)>第三聚类(Z0)>第二聚类(J2、H3、H4、Y4)>第一聚类(J1、J3、J4、Y1、Y2、Y3)>第四聚类(Z1、Z2、Z3)，苞片>茎≈叶片>种子(表3)。因此可以得出以下各部分化感作用强度顺序：苞片>叶片≈茎>种子。

表2 K-means聚类分析法的最终聚类中心

表3 聚类中心与综合化感指数比较

3 讨论与结论

化感作用广泛存在于植物与植物[33]、动物[8]、微生物[34]之间，种子发芽试验是验证受体植物所受化感作用的重要方式，种子的发芽对植物群落的演替和发展具有深远意义[35]。化感物质例如酚酸类物质通过对细胞膜系统造成过氧化损伤[36-37]导致细胞功能失调，进而影响细胞基本生理功能-光合作用、离子运输、水分吸收等，整体表现为干扰植物激素合成和ROS代谢[20]，从而影响种子发芽和幼苗生长。研究发现高浓度的茎、叶浸提液对白花泡桐种子发芽率、发芽势和发芽指数都有促进作用，但无明显的剂量效应，苞片浸提液则表现为低浓度促进，高浓度抑制，即化感作用强度为苞片>叶片≈茎>种子，其强度顺序与石秀梅等[38]对葎草总黄酮含量测定的结果相似：花冠>叶>茎>种子，由此可以推断：葎草对白花泡桐的化感作用与总黄酮含量有一定程度的相关性；葎草采收时期为秋季，与前人研究有所差异[26,39]，这时葎草已经结果，叶片部分积累养分的能力下降，各种营养物质由叶片向果实输送，所以苞片和种子中的化感物质含量更高，但苞片中化感物质含量更高，对种子萌发产生了更强的抑制作用，这与Ungar等[40]和潘慧超等[41]等的研究结果相似。

葎草不同部位的浸提液所含多种化感物质，各类物质之间协同、拮抗作用复杂[42]。高浓度茎浸提液对于茎长表现出显著抑制作用，低浓度茎浸提液具轻微促进作用；葎草叶、苞片浸提液对幼苗的茎长表现为不同程度的促进作用，促进作用程度为高浓度弱，低浓度强，Y3、H2、H3、H4都为显著促进。葎草茎、叶、苞片浸提液对于幼苗根长都呈现抑制作用，低浓度抑制作用弱，高浓度呈显著抑制作用，则说明植物的胚根、上胚轴这部分分生组织对于葎草中的化感物质更加敏感，与欧红梅等[43]发现的葎草地上、地下部分浸提液都有着“抑根促茎”的研究结果相似。

本研究中葎草茎、叶浸提液对幼苗鲜重产生促进作用，促进效果在14.81%～55.56%之间，只有Y1呈现轻微抑制效果；苞片浸提液对于鲜重高浓度显著抑制，低浓度轻微促进；说明葎草中含有能够影响白花泡桐幼苗同化CO2能力的化感物质，从而影响幼苗的生物量积累，而茎、叶中含量较苞片中此类物质含量低，因此茎、叶浸提液呈现促进作用，苞片浸提液呈现抑制作用。高浓度毛竹(Phyllostachysedulis)凋落物浸提液通过抑制延胡索(Corydalisyanhuuo)的光合特征来抑制植物的生长[44]；500 mg/mL的肉桂酸和对羟基苯甲酸打破ROS平衡，紊乱代谢，从而抑制植物生长[45]；川丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)水提液化感物质能够抑制受体植物愈伤组织的内源GA3、IAA激素合成，影响植物正常生长[46]；阿魏酸通过抑制小麦幼苗生长素氧化酶活性，累计植物激素来影响小麦生长[47]。因此，造成白花泡桐幼苗鲜重减小的原因较为复杂，有待进一步研究。

当植物受到化感物质胁迫时，受体植物会产生自我保护机制，通过调节自身抗氧化酶的活性来缓解由于化感物质影响产生的活性氧(ROS)的伤害[45]，其含量高低可表征植物受损程度。茎、叶浸提液对于白花泡桐幼苗SOD活性的影响表现为低浓度促进高浓度抑制，苞片浸提液对SOD活性的影响先上升再下降，在H3达到峰值，各浓度茎浸提液对幼苗POD活性都表现为抑制作用，但抑制作用随浓度的下降先下降后增强，叶和苞片浸提液则表现出明显的“低促高抑”现象。抗氧化酶活性出现“低促高抑”可能是由于植物受到过量的ROS伤害，超出了自身调节能力的上限，打破了ROS与酶系统的平衡，而这个“上限”均出现在0.050～0.075 g/mL处，导致抗氧化酶系统过载，清除能力下降，降低植物对逆境的耐受性。

化感作用的强弱可能受到生命形式(草本植物与木本植物)的影响，有研究发现草本植物比木本植物的化感潜力更强[48-49]。本研究中葎草苞片的化感作用强度范围可表示为0.100～0.025 g/mL为-0.49～0.12，叶表示为0.100～0.025 g/mL为-0.05～0.11，茎表示为0.100～0.025 g/mL为-0.01～0.13。相比于桑科其他物种，例如桑树(Morusalba)[50]根浸提液对两种茎瘤芥的化感强度80～1 g/L为-0.845～0.025，其抑制效果明显强于葎草，但促进效果弱于葎草；构树(Broussonetiapapyrifera)[51]浸提液对紫茎泽兰的30 ～2.5 g/L为-0.31～-0.05，抑制效果强，促进效果弱；无花果[52](Ficuscarica)树根浸提液对蒲公英、板蓝根、薄荷的化感作用25～8.3 g/L为-0.59～0，无花果茎浸提液对蒲公英、板蓝根、薄荷的化感作用25～8.3 g/L为-0.47～0.16，无花果叶浸提液对蒲公英、板蓝根、薄荷的化感作用25～8.3 g/L为-0.70～0.18，抑制效果和促进效果均强。以上桑科植物的化感作用强弱与其生命形式和生长年龄没有必然的联系，这与Zhang等[53]“多年生与一年生、草本与木本、野生与驯化植物之间的化感作用没有显著差别”的观点相似。

综上所述：不同部位不同浓度的浸提液对于不同的受体植株产生不同程度的化感作用，纵观葎草各部位浸提液化感综合效应指数，对白花泡桐发芽和发育能力的化感作用，抑制效果最强的是0.100 g/mL和0.075 g/mL的苞片浸提液，促进效果最强的则是0.050 g/mL的茎浸提液和0.025 g/mL的苞片浸提液；在白花泡桐种子与葎草种子混合发芽试验中，综合化感效应指数随着种子比值的减小呈现出线性负相关，低浓度的茎、苞片浸提液均能通过化感作用促进白花泡桐林木的更新，因此白花泡桐林地更新时可覆盖适量葎草茎、苞片促进幼树生长。对比聚类分析结果和化感效应指数之和结果，可以总结葎草各部位浸提液化感作用强度表现为：苞片>叶片≈茎>种子，可根据不同的需求进行化感潜力的开发利用。