贯叶连翘不定根总黄酮闪式提取工艺优化

李学峰， 孙浩丁， 吴晓晗， 范明智， 廉美兰， 朴炫春

(延边大学 农学院,吉林 延吉 133002)

贯叶连翘(HypericumperforatumL.)为藤黄科，金丝桃属，多年生草本植物[1]。主要分布于我国甘肃、四川和江苏等低海拔区域[2]。贯叶连翘味苦、涩、性平，地上部皆可入药，是我国传统的药用植物，贯叶连翘的有效成分有金丝桃素、伪金丝桃素和黄酮类化合物，金丝桃素和伪金丝桃素具有抗菌、止血、退热和治疗灼伤、外伤出血等作用，是很多人熟悉的民间药草[3-4]。因贯叶连翘的广泛应用前景，近些年来它的需求量急剧增加，但其野生资源由于人为的过度采挖受到了破坏，并且人工栽培的贯叶连翘产量和质量满足不了市场要求，因此，不定根培养就成为获取植物材料的另一途径[5]。目前，已有许多贯叶连翘不定根培养方面的研究报道[6-8]，但是对不定根提取工艺及后续的生物活性等方面的研究相对较少，使不定根的应用受到影响。

闪式提取技术是一种用于植物组织破碎的新型提取技术。它是靠高速机械剪切力和超动分子渗滤技术，在数秒钟内把植物材料破碎至细微颗粒，并使有效成分迅速达到组织内外平衡，通过过滤达到提取目的[9]。这种提取方法能最大限度保留植物有效成分，不会受热破坏、溶剂用量少、提取时间短的影响，效率高，且刀具耐磨，结构紧凑，使用安全可靠[10]。闪式提取技术的应用可加速中药现代化的进程，目前已应用于许多植物的提取,董科等[11]通过使用闪式提取高效地提取了植物多酚物质；莫一凡等[12]对无花果总黄酮进行闪式提取，对提取工艺进行了优化；王梦茹等[13]发现闪式提取法可有效地对黄芪中有效物质进行提取。然而，目前尚未发现闪式提取法应用于贯叶连翘的提取中。

因此，该试验对贯叶连翘不定根总黄酮进行了闪式提取，研究了提取溶剂、提取时间、提取溶剂浓度及液料比对黄酮得率的影响，在此基础上利用响应面设计对闪式提取工艺进行了提取工艺优化，为今后相关产品的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

参照于晓坤[14]的方法对贯叶连翘不定根进行生物反应器培养。不定根收获在45 ℃下烘干，将干燥的不定根用作提取的试验材料。

1.2 方法

1.2.1 闪式提取方法

闪式提取仪(上海钒帜精密设备有限公司)的电压调节为220 V，转数调节为5 000 r/min后进行提取。将提取的匀浆液过300目筛后，收集滤液，减压浓缩至膏状，烘干即得提取物。

1.2.2 单因素试验

1) 提取溶剂的筛选：取不定根干品10 g于闪式提取仪的提取容器，分别加入甲醇(80%)、乙醇(80%)和水3种溶剂，设置液料比为60∶1 (mL∶g)，提取时间为60 s进行提取，以黄酮得率为指标筛选提取溶剂。黄酮得率根据下式计算(下同)：

黄酮得率/%=黄酮含量/%×提取物提取率/%×100;

2) 提取时间筛选：取不定根干品10 g于闪式提取仪的提取容器，根据提取溶剂筛选试验结果，以80%的甲醇为提取溶剂，液料比为60∶1 (mL∶g)，将提取时间设置为30，40，50，60，70 s进行提取，以黄酮得率为指标筛选提取时间。

3) 溶剂浓度筛选：取不定根干品10 g于闪式提取仪的提取容器，根据提取时间筛选选定提取时间为60 s，液料比为60∶ 1 (mL∶g)，以甲醇为溶剂，将其浓度设置为20%，40%，60%，80%和100%后进行提取，以黄酮得率为指标筛选提取溶剂浓度。

4) 提取液料比筛选：取不定根干品10 g于闪式提取仪的提取容器，根据溶剂浓度筛选试验结果，以80%甲醇为溶剂，提取时间为60 s，将液料比分别设置为20，30，40，50和60 (mL∶g)后进行提取，以黄酮得率为指标筛选液料比。

1.2.3 闪式提取工艺的优化

在单因素试验的基础上，以提取时间(A)，溶剂浓度(B)，液料比(C)3个因素为自变量，利用响应面试验设计中的Box-Behnken设计进行3因素3水平的组合(表1)以甲醇为溶剂，根据各组合的条件进行闪式提取，根据提取物中黄酮得率(响应值)，确定最佳条件。

表1 响应面试验因素及水平

1.3 提取方法比较

以甲醇为提取溶剂，分别用闪式提取、超声提取和热水浸提法进行提取，比较了用不同提取方法对黄酮得率的影响。3种提取法的具体条件为：

1) 闪式提取：溶剂浓度为77.5%，提取时间为65 s，液料比为52∶1(mL∶g)。

2) 超声提取：溶剂浓度为50%，提取时间为40 min，液料比为10∶1(mL∶g)；提取温度为50 ℃，超声频率为40 kHz。

3) 热水提取：溶剂浓度为50%，温度为60 ℃，提取时间为60 min，液料比为10∶1(mL∶g)。

1.4 数据分析

利用 SPSS 22.0中的方差分析程序分析试验数据，用邓肯氏新复极差法进行比较，显著水平为0.05，每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂种类、提取时间、提取溶剂浓度及液料比对黄酮得率的影响

提取条件对黄酮得率的影响见表2。

表2 提取条件对黄酮得率的影响

由表2可知，当提取溶剂为甲醇时，黄酮得率明显高于乙醇和水溶剂，因此，选用甲醇作为提取溶剂。不同提取时间对黄酮得率的影响很大，提取时间为30～60 s时，随提取时间的增加黄酮得率呈上升趋势，在60 s达到最高(9.15%)，但当提取时间超过60 s时黄酮得率减少。提取溶剂(甲醇)浓度为20%～80%时，黄酮得率随甲醇浓度的增加而增加，用80%甲醇溶剂提取时，黄酮得率最高(9.86%)，但甲醇浓度超过80% 时，黄酮得率反而降低。液料比对黄酮得率也有很大影响，液料比从20∶1 (mL∶g)增加到50∶1 (mL∶g)时，黄酮得率呈上升趋势，在50∶1 (mL∶g)的液料比中黄酮得率最高(9.94%)，当液料比继续提高到60∶1 (mL∶g)时，黄酮得率反而降低。因此，选用提取时间为60 s，甲醇浓度为80%和料液比为50∶1 (mL∶g)的提取条件进行进一步的提取工艺优化试验。

2.2 提取工艺优化研究

根据单因素试验结果，选用甲醇作为溶剂，对提取时间、提取溶剂浓度及料液比进行了响应面设计，结果表明，不同试验组提取物的黄酮得率有很大差异(表3)。对建立的响应面设计模型，进行多元拟合回归分析，得到了二次回归模型方程：

表3 响应面试验设计与黄酮得率

Y=10.1+1.05A-0.7B+0.4C-0.05AB+0.4AC-0.15BC-1.05A2-3B2-1.5C2。

式中，Y为黄酮得率的预测值，A、B、C分别代表提取时间、提取溶剂浓度、液料比。

图1 预测值分析结果

从表4还可见，A、B、C的P值均小于0.05，说明提取时间、溶剂浓度和液料比对黄酮得率均具有显著的影响。3种因素的F 值从大到小的顺序为：A>B>C，表明对黄酮得率影响最大的是提取时间，其次是溶剂浓度，液料比的影响最小。另外，每两个因素间(A×B、A×C、B×C)交互作用均无显著性。

表4 方差分析结果

响应面分析法中，用试验数据绘制多元二次回归方程，进而预测最优工艺参数[17-19]。该研究结果的回归模型充分拟合试验数据，因此，用此模型分析结果可用于提取工艺的优化。从回归模型给出的最佳提取工艺，即提取时间为 65.44 s，甲醇浓度为 77.46%，液料比 52.13∶ 1 (mL∶g)，得到预测的响应值(黄酮得率)为 10.6%。为了验证预测值的准确性，该研究通过3次独立试验根据模型优化工艺进行了提取。3次重复试验的黄酮得率为10.41%、10.71%和10.59%，相对标准偏差(RSD)为 0.36%，表明3次重复试验结果稳定，且与预测值(10.6%)基本吻合。因此，该研究中响应面分析所预测的最优组合可用于实际提取工艺中。

2.3 闪式提取法与热水浸提法和超声波辅助提取法的比较

该研究将闪式提取法与超声提取法和热水回流法进行了比较。闪式提取法黄酮得率(10.57%)高于热水浸提法和超声波辅助提取法2种常规提取法(表5)，同时，闪式提取法与热水浸提法和超声波辅助提取法相比，在提取时间、提取溶剂和提取工作量上都相对较低，可在日后植物有效物质提取中进行推广与应用。

表5 不同提取方法对黄酮得率的影响

3 讨论与结论

目前，闪式提取法已应用于许多植物的提取中，但依据植物种类、提取的目标产物及提取部位，最佳提取条件有很大差异。如，张迪[20]用响应面法优化马鞭草中总黄酮闪式提取工艺的结果是提取溶剂乙醇浓度为50%，液料比为 35：1 (mL∶g)，提取时间为 1.5 min，提取次数为 2 次，在此条件下，总黄酮含量达到8.2 mg/g；王茜等[21]用响应面法和正交设计法优化黄蜀葵总黄酮闪提工艺的最佳条件为提取溶剂乙醇浓度为 75.01%，提取时间为93.56 s，提取次数为2次；邱相坡等[22]基于响应面法对连翘果实总黄酮进行闪式提取的优化工艺为液料比27∶1 (mL∶g)、闪式提取时间80 s和闪式提取电压109 V。此条件下总黄酮提取率达到了18.256%。

该试验对贯叶连翘不定根进行总黄酮闪式提取的最佳条件为65.44 s，提取溶剂(甲醇)浓度77.46%，液料比52.13 (mL∶g)。该研究在优化贯叶连翘不定根提取工艺时，黄酮得率达到10.57%，提取效果优于传统的超声波辅助提取和热水浸提法，是一种快速高效的提取方法。