SARS-CoV-2病毒E蛋白诱发A549细胞炎症反应研究

夏 雯，殷云良，焦玉东，付士祥

(1. 镇江高等专科学校 医药技术学院，江苏 镇江 212028； 2. 镇江新区生态环境和应急管理局 应急管理科，江苏 镇江 212132；3. 扬州市第三人民医院 呼吸科，江苏 扬州 225000)

自2019年底开始在全球流行的新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)属于有包膜的β属冠状病毒，与蝙蝠体内分离的SARS病毒基因同源性高达85%，但尚无任何直接证据证实其来源于蝙蝠[1]。SARS-CoV-2主要依靠呼吸道飞沫传播，受感染者会出现发热、乏力和干咳等早期症状，并迅速蔓延至下呼吸道，出现新型冠状病毒肺炎(COVID-19)症状，严重者还会出现急性呼吸窘迫综合征和多脏器功能障碍综合征甚至死亡[2]。现有研究表明，“细胞因子风暴”(cytokine storm)可能是SARS-CoV-2诱发急性呼吸窘迫综合征的重要因素。免疫系统调控失衡使得大量促炎细胞因子爆发性释放，对机体的损害远大于病毒本身，但目前对于SARS-CoV-2诱发“细胞因子风暴”的确切机制仍不清楚[3]。E蛋白是冠状病毒最小的结构蛋白，属于跨膜整合蛋白[4]。E蛋白不仅参与子代病毒的组装和释放，还与其致病能力密切相关。因此，针对E蛋白通道活性的阻滞剂，可阻断病毒复制、组装出芽及致病[5]。笔者通过优化最适条件表达E蛋白，其纯化后可被新冠病毒感染治愈患者体内的E蛋白抗体所识别，为SARS-CoV-2抗原蛋白检测提供支持。同时研究E蛋白激活人肺泡上皮细胞来源的A549细胞炎症反应，旨在深入了解该病毒的致病机制。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠埃希菌BL21(DE3)株由江苏大学医学院临床检验诊断学研究所保存，人肺腺癌(A549)细胞购自中科院上海细胞库。胎牛血清、RPMI1640培养液购自美国Gbico公司。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、Ni-NTA介质购自德国Qiagen公司。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗人IgG购自武汉博士德公司。PVDF膜(0.45 μm)购自Millipore公司。质粒小量提取试剂盒、DNA marker和蛋白质相对分子质量(Mr)marker购自上海捷瑞公司。PCR仪、蛋白电泳转印套件及凝胶成像仪均购自Bio-Rad公司。PCR引物由苏州金唯智公司合成。液相去内毒素试剂盒购自北京天恩泽公司。硫酸卡那霉素购自上海阿拉丁公司。细胞/组织总RNA提取试剂盒(TRIzol法)、BCA蛋白定量试剂盒购自南京诺唯赞公司。

1.2 方法

1.2.1 重组E蛋白(rE protein)原核表达载体构建

由武汉金开瑞生物工程有限公司合成SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/human/TUN/TUN-20211890/2021株)E蛋白基因(MW463889.1)，并通过EcoR V/Nco I定向克隆至 pET28a载体上，并经过限制性内切酶酶切和DNA测序验证，保证插入序列完全正确。

1.2.2 重组E蛋白表达纯化

将已构建的pET28a-rE protein重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)株，挑取单个菌落接种于含50 mg·mL-1卡那霉素的LB液体培养基，37 ℃振摇培养至培养液A600=0.6，温度降至30 ℃，分别加入终浓度为0.4 mmol·L-1和1 mmol·L-1的IPTG诱导表达，在2 h，4 h，6 h，8 h，10 h收集菌体，使用SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况以确定最佳诱导条件。按最佳诱导条件，大量扩增细菌，收集菌体，采用Ni-NTA介质纯化重组E蛋白，并去除内毒素后用于细胞实验。

1.2.3 重组E蛋白浓度测定

采用BCA法测定重组E蛋白浓度。将标准品倍比稀释，绘制成标准曲线，洗脱液调零。按说明书推荐，A ∶B = 50 ∶1制成AB混合液。每个样本2个复孔，每孔加入10 μL蛋白和200 μL AB混合液。37 ℃避光显色30 min，使用多功能酶标仪读取562 nm处的光密度。根据标准曲线计算相应浓度。

1.2.4 重组E蛋白与新冠病毒感染治愈患者血清反应

选取3名扬州市第三人民医院收治的临床确诊新冠病毒感染患者，于治愈出院时采集血清样本，以健康者血清为对照。采用Western blotting法进行检测，具体方法如下：取0.1 mg重组E蛋白与5×SDS上样缓冲液混匀，煮沸10 min后进行SDS-PAGE；将目的蛋白以300 mA，90 min条件下转印到PVDF膜上，50 g·L-1脱脂奶粉室温封闭60 min，以健康者血清和新冠病毒感染患者血清(1 ∶200)为一抗，4 ℃过夜孵育，TBST洗涤3次，以HRP标记的山羊抗人IgG(1 ∶1000)作为二抗，室温孵育1 h；TBST缓冲液洗涤3次后加入ECL显色，观察结果。

1.2.5 NLRP3炎症复合体mRNA表达量检测

A549细胞以每孔1×106的数目接种6孔细胞培养板，分别以10 μg·L-1和100 μg·L-1重组E蛋白处理A549细胞1 h。实验结束时收集细胞并提取细胞总RNA，用于实时定量PCR法检测。具体方法为：以TRIzol法提取细胞总RNA，以HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒去除总RNA中基因组DNA并逆转录为cDNA，采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒检测NLRP3，Caspase-1和IL-1β的mRNA表达量。引物序列及反应条件参考文献[5]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 重组E蛋白表达纯化

携带pET28a-rE protein重组质粒的BL21菌，在30 ℃，1 mmol·L-1IPTG诱导8 h可获得最大表达量。经Ni-NTA介质纯化后，SDS-PAGE分析可见Mr 83 00处有特异蛋白条带，与预期SARS-CoV-2病毒E蛋白相对分子量大小一致，表明E蛋白表达成功。结果见图1。

图1 重组E蛋白表达纯化

2.2 重组E蛋白与新冠病毒感染治愈患者血清反应

Western blotting实验结果表明，当以HRP标记的山羊抗人IgG为二抗时，新冠病毒感染治愈患者体内E蛋白抗体能被检出，而健康者血清样品未被检出，说明重组E蛋白能够被新冠病毒感染治愈患者血清中E蛋白抗体所识别。结果见图2。

1： 健康者；2～4： 3名新冠病毒感染治愈患者

2.3 重组E蛋白诱导A549细胞NLRP3炎性复合体活化

与对照组比较，10 μg·L-1组和100 μg·L-1组细胞的NLRP3，Caspase-1和IL-1β mRNA表达量均显著升高(P<0.05)，且100 μg·L-1组显著高于10 μg·L-1组(P<0.05)。结果见图3。

*： P<0.05，与对照组比较；#： P<0.05，与10 μg·L-1组比较

3 讨论

E蛋白属于冠状病毒膜孔蛋白家族，是一种在病毒生命周期中重要的功能性小跨膜蛋白[6]。病毒膜孔蛋白可在宿主细胞膜上多聚化，形成亲水性离子通道，增加宿主细胞膜对各种离子(包括Na+、K+、Ca2+、H+、Cl-)的通透性，进而影响病毒的入胞、基因组复制、子代病毒的组装和出芽，因此E蛋白对于冠状病毒的正常增殖具有重要意义并直接影响病毒致病性[7]。研究表明，敲除猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus)和MERS-CoV病毒基因组中E蛋白编码基因后，病毒虽然能够复制，但是不能感染新的细胞。敲除SARS-CoV-1病毒基因组E蛋白编码基因后，病毒虽然也能够在体外培养的Vero细胞中复制增殖，但病毒滴度较野生株下降了20～1 000倍。动物实验研究也表明，缺失E基因的SARS-CoV-1病毒毒力大大降低，其诱发宿主炎症反应水平也显著降低[8]。但目前对SARS-CoV-2病毒E蛋白诱发宿主细胞炎症反应能力尚缺乏研究。

笔者成功纯化获得重组SARS-CoV-2病毒E蛋白，该重组蛋白能够被新冠病毒肺炎治愈者血清中抗体所识别。最新研究表明，NLRP3炎症复合体的过度活化可能是诱发SARS-CoV-2病毒感染者严重并发症的“罪魁祸首”。活化的NLRP3炎症复合体通过细胞内Caspase-1触发免疫反应，释放大量促炎细胞因子(如IL-1β和IL-18)，并且通过在细胞膜中产生Gasdermin D孔通道，介导细胞“焦亡”发生[9]。 在感染早期，NLRP3炎症复合体的激活以及促炎细胞因子的释放有助于患者清除病毒，但随着体内病毒数量增多，NLRP3炎症复合体活化的增加以及大量促炎细胞因子释放，在杀伤SARS-CoV-2病毒的同时，也造成了“细胞因子风暴”，患者正常组织和细胞也因过度炎症反应而受损[10]。此外，SARS-CoV-2病毒不仅可以活化患者体内巨噬细胞和黏膜上皮细胞内NLRP3炎症复合体，甚至可以通过造血干/祖细胞(HSPCS)表面血管紧张素转换酶2受体(ACE2)进入HSPCS细胞内，激活此类细胞的NLRP3炎症复合体，进而诱发“细胞因子风暴”[10]。

4 结束语

SARS-CoV-2病毒E蛋白作用于A549细胞1 h时，在感染早期即可诱发黏膜上皮细胞炎症反应，促使细胞释放活性氧和促炎细胞因子，加重患者炎症损伤，进而加重病情。寻找改善患者炎症损伤的方法则有待更多研究。