南京地区无偿献血人群输血传播HBV残余风险度评估研究*

黄敏 李燕 张立波 傅强

中国是HBV流行高发地区，近年我国人群HBV流行率的调查显示约为6.89%，东部地区为6.16%[1-2]。国内血站1975年起就将HBV筛查作为必检内容。2015年至今血站HBV的筛查除了使用血清学方法—酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assays，ELISA）和化学发光免疫分析试验（chemiluminescent microparticle immunoassay，CLIA）以外，还在全国范围内全面使用核酸检测方法（nucleic acid testing，NAT）—包括单人份核酸检测（individual donation nucleic acid testing，ID-NAT）和混样核酸检测（mini-pool nucleic acid testing，MP-NAT）。虽然目前这些检测手段已将输血传播病毒的风险降低，但检测后仍然存在残余风险。而血筛残余风险的评估，无论对卫生行政部门输血安全管理的决策、临床医生根据利弊平衡原则掌握是否给患者输血，以及拟接受输血的患者对输血风险的知情同意，都是重要的基础数据。世界范围内关于献血人群HBV传播残余风险度评估研究工作一直没有停止过，我国在这一领域相对滞后。造成HBV输血传播残余风险的原因有多种，主要有：①人群中HBV流行率；②采供血机构的检测原因，包括试剂灵敏度、不同种试剂组合的筛查模式、筛查策略、实验室的质量管理等等；③医疗机构临床用血的管理；④用血患者本身的免疫特点。目前世界范围内对于HBV输血传播残余风险的研究以①②为主，多数计算残余风险度的数学模型即以此为基础，采用血筛阳性率和窗口期等参数来估算残余风险。本文仅就原因②中的筛查模式进行了初步探讨。对此，本文选取2021年3月1日～2021年8月31日南京地区的献血人群作为研究对象，对该人群HBV血筛残余风险度的影响因素进行了初步评估研究。

材料与方法

1 研究对象与筛查模式 本文选取2021年3月1日～2021年8月31日南京地区的献血人群作为研究对象，共筛查52367人次，日常血液筛查策略为“2遍HBsAg血清学筛查+1遍HBV DNA核酸筛查”（文中简称“2+1”），文中将其中包含的“任1遍HBsAg血清学筛查+1遍HBV DNA核酸筛查”看作“1+1”筛查策略（文中简称“1+1”）。“2+1”策略中的2遍HBsAg血清学筛查分别采用2种HBsAg ELISA血清学筛查试剂（文中简称E1和E2），1遍HBV DNA核酸筛查采用2种不同的HBV DNA核酸筛查方法（ID-NAT/MP-NAT）中的1种，其中ID-NAT共筛查26812人次，MP-NAT共筛查25555人次。这4种血液筛查试剂形成的不同组合模式文中简称筛查模式。E1和E2为2种国产HBsAg ELISA血筛试剂，ID-NAT试剂为进口Procleix Ultrio Elite Assay联检和鉴别试剂，采用转录介导的核酸扩增技术（transcription mediated amplification，TMA）原理；MP-NAT试剂为国产6混样NAT试剂，采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术。以上试剂均经过国家批批检，参与室间质评100%通过。

2 筛查结果判定规则

2.1 HBsAg血清学阴性结果的判定规则：HBsAg ELISA初筛为非反应性，或HBsAg ELISA初筛反应性后再进行双孔复试、双孔均为阴性，以上两种情况最终均判为ELISA试剂HBsAg阴性。

2.2 HBV DNA阳性判定规则：ID-NAT试剂初筛反应性后进行鉴别实验，鉴别结果呈HBV DNA反应性即判为HBV DNA ID-NAT试剂最终阳性；MP-NAT试剂混样检测反应性后再进行拆分实验，拆分结果呈HBV DNA反应性即判为HBV DNA MP-NAT试剂最终阳性。

2.3 HBsAg阴性同时HBV DNA阳性判定规则：HBsAg血清学筛查试剂结果均为阴性、同时1种核酸筛查试剂结果为HBV DNA阳性，则该份样本最终判为HBsAg阴性同时HBV DNA阳性。

3 残余风险度评估方法 本研究采用已有成熟的NAT单阳性率-窗口期比率（NAT yield/WP ratio model）数学模型[3-4]做HBV输血传播残余风险度的回顾性评估。模型计算公式：RR = WPNAT/（WPHBsAg–WPNAT）×（NWPNATyields/Ndonations）。其中参数RR是残余风险度（residual risk，RR），单位：/1000 000人年（person-year，py），由于多数文献采用/106py作为RR的单位，为了便于可比，本文也采用/106py，这与NWPNATyields/Ndonations的单位不同，因此文中RR的计算需要对人年进行换算，2021年3月1日～2021年8月31日共184天，换算为0.5人年（文中计算采用原始多位小数结果），最终在WPNAT/（WPHBsAg–WPNAT）×（NWPNATyields/Ndonations）的基础上乘以0.5再乘以10，文中（NWPNATyields/Ndonations）数据已乘以人年数；WP是窗口期（window period，WP），是指从献血者感染病毒且具有传播能力开始，到实验室能够检出的时间（year）。本研究窗口期参数均来自文献，WPNAT是HBV DNA核酸筛查方法的窗口期时间，其中混样核酸筛查方法采用24.5天（8混样核酸检测数据）[5]，单人份核酸筛查方法采用18.5天[6-7]； WPHBsAg是HBsAg的血清学筛查方法的窗口期时间，ELISA方法采用59天[8-10]。WPNAT/（WPHBsAg–WPNAT）为窗口期比率。计算不同筛查策略和筛查模式的残余风险度时，按照高估风险的原则，根据策略或模式中所包含的试剂方法来选择最长窗口期，具体计算方法：“ELISA+ ID-NAT” 的窗口期比率为18.5/（59-18.5）=0.46，“ELISA+ MP-NAT”的窗口期比率为24.5/（59-24.5）=0.71。NWPNATyields是HBsAg阴性同时核酸阳性的献血者人次数（文中简称NAT单阳性数）；Ndonations是核酸筛查总献血者人次数，文中称筛查总数；（NWPNATyields/Ndonations）是HBsAg阴性同时核酸阳性的人次数占献血者核酸筛查总人次数的比率，文中简称NAT单阳性率。单位：/100000人年。该参数采用2.3的结果。

4 统计学处理 采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析。RR的影响因素采用卡方检验法分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

2021年3月1日～2021年8月31日，共筛查南京地区献血者52367人次，不同筛查策略和筛查模式对其HBV血筛残余风险度的影响均未见显著的统计学意义。结果见表1。

表1 不同筛查策略和筛查模式对南京地区献血者HBV血筛残余风险度的影响（n=52367）

讨论

本研究选用了NAT单阳性率-窗口期比率模型，该模型兼具优势与局限性。目前国际国内常用的HBV输血残余风险数学模型有①经典的I-WP模型，包括Muller-Breitkreutz model和Modified Incidence/WP model[11-12]，②NAT yield/WP ratio model[3-4]， ③以HBsAg检出率法为基础的新感染率-窗口期模型[13]， ④流行率-窗口期模型[14]， ⑤Seed模型（建立在流行率-窗口期模型基础上）[15]等等。我国对于该领域研究起步较晚，①③④模型都有相关研究报道[16-18]，但考虑到部分研究方法的争议[19-20]，本文经过取舍，选取了②NAT yield/WP ratio model。该模型适合评估HBV高流行地区，具有简便易算的优点，只需要输入所有献血者的NAT单阳性率（即NAT阳性同时HBsAg阴性）和窗口期参数即可，并不需要区分初次献血者和重复献血者。但由于该模型的含义是指血筛残余风险完全来自于NAT窗口期，具有局限性，主要表现在以下几方面：第一，窗口期的精确估计非常困难，在病毒感染早期，病毒颗粒会局限在接种点或实质靶器官，不会立即进入血液，不会立即达到足够的载量进行有感染性的传播，因此有许多科研团队对窗口期的确定进行反复精确的试验，通过计算病毒倍增时间来推算具有感染性的窗口期时间，并相应调整其他时间参数[21]；第二，该模型与众多数学模型一样，缺少考虑临床受血者感染的风险[15]；第三，该模型要求NAT单阳性率足够高，否则会影响模型计算的准确性[11]；第四，NAT单阳性结果必须可靠，最好是真正意义上的“窗口期”，因此所有NAT单阳性结果需要经过确认和分类。实际上，目前我国大陆血站没有强制对NAT结果进行确认和分类，NAT单阳性不能排除假阳性的存在，且大部分这种样本的病毒浓度很低，很难对献血者的血液状态进行追踪，另外本中心NAT单阳性结果中必然含有相当数量的OBI（隐匿性乙肝病毒感染）结果，这一比例在南非为4%，而在亚洲和欧美国家达到了12%[11]和19.4%左右[5]，我国部分高流行地区为2.92%[22]，有报道称急性隐匿性或乙肝疫苗抗-HBs突破/流产感染，均为短暂的低水平HBsAg血症（前者抗-HBs阴性，后者抗-HBs阳性），即NAT单阳性结果，这种情况导致的残余风险也被考虑到NAT单阳性窗口期比率模型中；同时对于受血者来说，相当一部分免疫接种人群对于低病毒载量的血液不易感，NAT单阳性结果的存在并不意味着能通过输血传播HBV。综上所述，以上种种因素导致NAT单阳性窗口期比率模型计算出的残余风险度往往会高于其他涉及HBsAg阳性数的模型[11]，有高估残余风险的可能。同时有研究表明，OBI献血者标本由于多数浓度偏低，其中仅有12.8%能被MP-NAT（16混）检测到[4]，由此得到的MP-NAT单阳性率与ID-NAT相比必然偏低，但同时窗口期前者偏长，该模型最终计算得到的残余风险度有可能相差不大甚至前者更小（见本文结果）。因此有文章将数学模型做分类加权[8]，每种类别的检出概率不同，风险也不同，这样调整后的风险度更加可靠，但由于人们对风险度估算倾向于偏高，因此WHO相关指南[8]也建议如果调整后风险减小则没有调整的必要，而本文涉及的模型本身就具有高估风险的特点，而且数据有限，因此本文没有考虑采纳。

NICO LELIE等发现该模型计算得出的东南亚地区残余风险度（ID-NAT）为1∶3115～1∶5780，南非为1∶2188～1∶4049[11]。从本文结果可以看出，不论采用哪种模式，本中心血筛残余风险度在1∶6085～1∶7933之间，位于可接受范围内，甚至低于东南亚总体RR水平。与世界范围的其他国家相比，本中心HBV血筛残余风险度高于欧美发达国家 （1∶ 115000～1∶8000 000），同时也高于曾经被WHO认为是HBV中高程度的流行地区，如巴西（1∶29411）、韩国（1∶39956）等地区[5，23]。但与我国大陆地区未开展NAT血筛之前的报道（1∶1769）[17]相比，目前的残余风险度总体明显有所下降。一方面这可能与近几年NAT的广泛开展有关，我国从2015年开始NAT血筛全面覆盖，相关文献显示，不论是MPNAT还是ID-NAT[23-24]，与传统的血清学检测手段相比，NAT能够明显降低血筛的残余风险；另一方面，本文首次使用了新的风险评估模型，该模型与过去的传统模型相比，对于残余风险度的评估更加严格和保守，得出的结论往往比实际偏高。真实的结论还需要对模型参数的来源进行更多探讨和研究。然而不论如何，在与国际范围内的其他地区横向比对后，我国的血筛残余风险度水平仍然不容乐观，在献血者招募和宣传教育、血筛技术和策略、血筛试剂改进、临床用血等方面，我们还有很多工作可以做。

不同的筛查策略会导致不同的残余风险度水平。《血站技术操作规程（2015版）》对血站的检测策略（简称新策略）进行了更新：实施核酸检测试剂批签发之后，HIV、HBV和HCV感染标志物应采用核酸和血清学检测2种方法各进行1次检测[25]，也就是通常所说的“1种血清学检测+1种NAT”的筛查策略。新版《血站技术操作规程（2019版）》检测策略中提到：HIV、HBV和HCV感染标志物应至少采用核酸和血清学试剂各进行 1 次检测。新版中增加了“至少”二字，也是由于国内多数研究认为“2+1”比“1+1”的筛查策略更加安全[18]。但从本文结果中可以看出，2种筛查策略并没有明显的统计学差异。值得关注的是，未发表的数据显示有5例E2和NAT结果均呈阳性的样本E1呈阴性，可能与E1试剂的灵敏度及其对某些变异型病毒的检出能力有关。如果按照“1+1”策略进行血筛，E1与NAT的组合模式完全依赖于NAT的灵敏度和可检靶基因的覆盖程度，可能造成这5例阳性样本的漏检。尽管从总体统计学角度来看2种筛查策略没有显著差异，但接近1/10000（5/52367）的漏检率从受血者角度来看，一旦发生就是悲剧。因此单从统计学角度并不能绝对认为2种策略同样安全，这一点从以往的文献中也多次得到印证。

不同的筛查模式对血筛残余风险度的影响主要取决于试剂灵敏度和对某些变异型、亚型病毒的检出能力等。从结果中可知，含有E1的筛查模式要比含有E2的筛查模式残余风险度高，同时E1确实有5例阳性样本未检出，这可以给“1+1”策略中保留哪1种ELISA试剂提供参考。有意思的是，结果显示含有ID-NAT的筛查模式要比含有MP-NAT的筛查模式具有更高的残余风险度，这在前面分析中提到，可能与ID-NAT灵敏度高，导致NAT单阳性率高有关，IDNAT采用单人份检测，且初筛反应性即判为阳性（不用等鉴别结果即报废），而MP-NAT采用6人份混样检测，且混样加拆分均为反应性才判为阳性，势必造成前者NAT单阳性率高于后者。尽管窗口期参数前者短于后者，但最终结果往往不能确定哪个更高。如果本文样本量增大，并增加确认实验，排除假阳性可能，或许将得到更加准确的结果。这也是本研究的不足之处，将在今后的工作中继续完善。同时这也体现了数学模型的局限性，参数的准确性非常重要，但实际很难得到，世界上目前也没有统一的标准，这需要科研人员尤其是国内的科研人员做出更多的努力。随着研究工作的逐步完善，数学模型的准确性也将会有更多的提升。

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