血液成分中病原体灭活技术及其研究进展

康澜 李世林 杨春晖

自输血医学学科成立以来，血液供应的安全性就一直备受关注。在过去的几十年里，无论是在发达国家还是发展中国家，血液安全都取得了重大改善。献血者筛查、延期献血、血液检测以及对血液供应链中的每一步进行严格管控的策略都大大降低了输血传播疾病的发生率。但是，血液安全仍然是一个值得关注的问题，因为不断有新的病原体出现来威胁血液安全。而现有的病原体筛查手段，仍不能解决病原体带来的所有问题，这是因为（1）即使是最先进的核酸检测方法也不能完全消除“窗口期”的存在；（2）目前只能对已被认识且可以进行检测的病原体进行筛查和检测，且并非所有公认的威胁都能得到根本的解决；（3）从卫生经济学的角度考虑，对病原体的筛查不可能无限制地扩大。因此，站在受血者的立场考虑，提高血液安全的理想策略就是引入病原体灭活，该技术可以广谱消除血液中的病原体，有效预防新发再发病原体的传播，弥补其他检测手段的不足，进一步降低输血传播病原体的残余风险。目前，血液病原体灭活技术已在多个国家得到了应用，如我国部分血站使用的亚甲蓝（methylene blue，MB）光化学法、在多个欧洲国家应用的补骨脂素（amotosalen/S-59）光化学法和核黄素（riboflavin，RB）光化学法等。而另一些新的病原体灭活技术仍处于临床实验或研究探索阶段，如S-303法、THERAFLEX UV、低温等离子技术、飞秒激光/超短脉冲激光、高静水压技术等。我们将在下文中对这些病原体灭活技术的应用及研究进展进行介绍。

1 已应用的血液成分病原体灭活技术

1.1 光化学法：光化学技术是生物光动力敏化作用。在血液成分中加入光敏剂后，一定波长光的照射下，光敏剂可以吸收光能进而发生光化学反应，破坏核酸，阻断病毒复制，从而达到灭活病毒的目的。

1.1.1 亚甲蓝光化学法：MB是一种光敏性吩噻嗪染料。在欧洲用于单人份血浆的病原体灭活已有15年以上。MB对核酸和病毒表面具有亲和力，它可以直接插入核酸分子螺旋之间，或结合在螺旋表面，进而发生鸟嘌呤特异性切割。在缺乏氧气环境的溶液中，直接电子转移可能是造成磷酸二酯键断裂的原因，使鸟嘌呤残基处的链断裂。在富氧溶液中，可形成活性氧（iO2，OH，超氧化物）[1]，导致鸟苷氧化。在可见光波长的存在下（MB在620～670 nm处有峰值吸收），Ⅰ型（氧化还原）和Ⅱ型（光氧化）反应都可以发生，核酸分子的这些变化最终阻止了病原体的复制。MB技术已经显示出可以灭活包膜病毒和某些非包膜病毒，如丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、黄热病病毒（yellow fever virus，YFV）、寨卡病毒（zika virus，ZIKV）等[2-3]。 但是，鉴于其具有一定的疏水性，该化合物无法穿透质膜灭活细胞内病毒，且不能破坏白细胞，因而不能降低输血相关移植物抗宿主病（transfusion associated graft versus host disease，TA-GVHD）的发生率，也无法应用于红细胞（red blood cell，RBC）成分的灭活。尽管MB不会使细胞内病毒灭活，但是血浆的冷冻和解冻通常会破坏白细胞的细胞膜，从而释放病毒颗粒，并使它们易受MB的影响。MB作为外来物质，在灭活过程结束后会有残留。通过使用MB过滤器，就能除去95%以上的残留染料和光导副产物[4]。

目前，该技术主要用于单袋血浆病原体灭活，也是我国唯一批准用于临床的单袋血浆病原体灭活法，其也在奥地利，白俄罗斯、希腊、意大利等多个国家批准使用[5]。

1.1.2 补骨脂素S-59光化学法：S-59是从芹菜、萝卜等植物中发现的。补骨脂素是平面杂环芳香小分子，具有高度水溶性，可以快速通过细胞膜、细菌壁或病毒包膜，并容易嵌入到DNA或RNA的双螺旋结构中。在紫外线A（UVA）照射下，其反应基团和嘧啶碱基形成单加合物，单加合物导致螺旋稍微展开[6]。核酸分子螺旋展开后，在UVA的持续存在下可以形成第二个加合物，它与原始加合物形成交联。单加合物的不断产生，加上交联是无法逆转的，使得病原体核酸无法复制，达到灭活病原体的效果。

Cerus公司将S-59与UVA结合，开发了INTERCEPT系统。早期，LILY LIN等[7]的实验中就用数据证明补骨脂素和长波紫外光可灭活血小板浓缩液（platelet concentrate，PC）中多种致病细菌，如金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌等，表现出预防血小板输注相关菌血症的潜力。多项研究[8-9]相继证实通过使用补骨脂素和紫外线可灭活血浆和血小板中多种病毒和寄生虫，如恶性疟原虫、YFV等，证实INTERCEPT系统具有降低各地区血浆和PC中病原体经输血传播感染的风险。瑞士是从2011年开始在全国范围内实施INTERCEPT系统的第一个国家，目前已在全球约30多个国家/地区常规使用[8]。

S-59能穿透细胞膜，相较于MB而言，S-59拥有破坏多种病原体及细胞内核酸的优势。该技术可用于血浆和血小板，但不能用于红细胞，因为血红蛋白会吸收UVA，影响S-59的活化。光化学处理的血浆中大多数凝血因子在73%～98%范围内保存良好，Ⅷ因子水平虽然降至73%，但仍足以用于治疗。此外，INTERCEPT系统能够灭活残留的供体白细胞[10]，包括T细胞，可以预防TA-GVHD。但是，用INTERCEPT系统进行处理后有约20%的S-59及部分光副产物残留[11]，这有可能成为潜在过敏原。

1.1.3 核黄素光化学法：核黄素是一种必需维生素（维生素B2），是一种三环平面结构的芳香族化合物，可与核酸结合并插入DNA和RNA碱基之间。Ⅰ型和Ⅱ型光化学反应均可以介导核黄素的作用机理。用紫外线或可见光激活后，核黄素通过直接电子转移反应氧化DNA和RNA中的鸟嘌呤残基，这种反应发生在没有氧气的情况下。而在有氧情况下，则会产生超氧阴离子O–2和HO2[12]，导致鸟嘌呤的光氧化，从而破坏核酸，灭活病原体。Terumo BCT公司将核黄素与紫外线（280～400 nm）相结合开发了灭活血浆和血小板中病原体的Mirasol系统。已证明Mirasol系统对许多病原体具有不同程度的灭活作用[13]，尤其对包膜病毒最有效。

核黄素被美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）鉴定为GRAS化合物（指安全的化合物）。相对于INTERCEPT系统而言，血浆和血小板经Mirasol系统处理后，不需要对残留物及代谢产物进行额外的去除步骤。FⅡ、FⅧc和FⅤ的活性保留率分别为80%、75%和73%。抗凝血酶、蛋白S、纤溶酶原和α2-抗纤溶酶活性保持率在91%到100%之间[14]。FⅧc是血浆中最不稳定的蛋白之一，通常受各种病原体灭活过程的影响最大。核黄素和紫外线处理的血浆也显示FⅧc水平降低（75%的保留率），相比之下，MB处理的血浆中FⅧc保留率降至67%[14]。Mirasol系统用于红细胞病原体灭活也仍在开发中。因为红细胞存在储存损伤现象，RB/紫外线可加速红细胞存储损伤并促进红细胞程序性死亡[15]。

1.2 有机溶剂/去污剂法（solvent / detergent，SD）：SD灭活技术于1985年第一次许可用于处理凝血因子浓缩物。SD法是通过有机溶剂（如三正丁基磷酸盐，TNBP）和去污剂（如聚乙二醇辛基苯基醚，TritonX-100）相结合来破坏病原体的膜，直接达到灭活目的。该方法的靶标是脂质，对于包膜病毒、胞内病毒、细菌和真菌的灭活都非常有效[16]。虽不能使非包膜病毒失活，但可以有效阻止这些病原体的传播。

SD法目前主要用于灭活血浆，处理步骤多，不适用于单一供体处理。最常见的两种血浆产品一是来自单个献血者的新鲜冷冻血浆（fresh frozen plasma，FFP），二是经过SD法处理的汇集血浆SDFFP。通过使用SD-FFP对凝血因子缺乏症、免疫性血栓性血小板减少性紫癜等进行的研究证明了SD-FFP的耐受性和安全性[17-18]。SD法是目前对汇集血浆进行病毒灭活的唯一技术，也是使用最广泛的病原体灭活技术。

SD治疗的好处在于，除了可灭活常规筛选分析中未检出的包膜病原体外，还能够保留血浆蛋白的功能活性。SD血浆的一个缺点是SD过程不可避免地降低了α2-抗纤溶酶和蛋白S的水平[19]，并可能增加肝纤维化期间发生过度纤维蛋白溶解或血栓栓塞事件的风险。但尚无针对此类不良事件的详细资料，也未发布有关高纤蛋白溶解或血栓栓塞的发病率数据。

表1 病原体灭活技术在血液成分中的应用

2 尚未进入临床使用的血液成分病原体灭活技术

2.1 THERAFLEX UV技术：THERAFLEX UV是由法国Macopharma公司开发的，该技术仅依靠短波（254 nm）紫外线C（UVC）通过与核酸的直接相互作用来灭活病原体。UVC通过诱导嘧啶二聚体的形成，阻止核酸转录本的延长[20]，且大多数二聚体是在相邻的嘧啶之间形成的。此外，它也会产生涉及位于不同DNA链上的碱基损伤。尽管启动DNA修复可以抵消这种有害影响，但若病毒、细菌或细胞DNA或RNA的损伤程度超过修复能力，则病毒、细菌将死亡或宿主细胞将无法允许相应病毒的复制。这种作用机制对细胞外和细胞内经输血传播的病原体具有广泛作用，如日本脑炎病毒[21]（japanese encephalitis virus，JEV）、戊型肝炎病毒[22]（hepatitis E virus，HEV）等。

THERAFLEX UV技术所采用的光波长较短，它的反应性在混浊或者含有蛋白质的溶液中容易被淬灭，只有在相对透明的介质中最有效，所以目前主要用于灭活血小板中的病原体。已证明用254 nm的波长和0.2 J/cm2的能量剂量进行处理可有效减少病毒、细菌和寄生虫，同时保持可接受的血小板质量水平[23]。该技术简单、便捷且无需添加任何化合物，很容易在现有的血库程序中实现。

由于无需添加任何光敏剂，THERAFLEX UVPlatelets系统处理后无需过滤，因此无需进行常规药代动力学和毒理学评估，没有光产物或杂质产生不利影响的风险。在第一阶段的临床试验中，研究人员对所有志愿者重复输注自体经UVC处理的血小板浓缩物，没有观察到与输血有关的不良反应，也不会诱导产生相应抗体。目前，THERAFLEX UV-Platelets系统正在进行3期临床试验。

2.2 S-303法：S-303是一种专为红细胞病原体灭活而设计一种烷基化剂，属于一类“易碎锚连接效应子”（FRALE）化合物。FRALE化合物由三部分组成，包含插入DNA和RNA螺旋区域的嵌入基团（核酸锚）、允许核酸共价连接的效应基团和协调化合物降解的中央易碎键[24]。FRALE化合物不依赖于光来激活，而是通过从较低的pH储存环境转变为较高的pH来活化。锚通过选择性地靶向核酸并可逆地结合到DNA和RNA的螺旋区域，效应基团与鸟嘌呤碱基发生不可逆反应，产生加合物和交联，防止核酸复制、转录或翻译。这种作用模式可在数小时内灭活细胞内外病原体。

在第一代S-303系统中，发现少数接受S-303 RBC输血的患者体内存在抗S-303 RBC抗体。随后，第二代S-303系统加入了谷胱甘肽（Glutathione，GSH）并增加其用量，解决了抗体形成问题。S-303/GSH也证明了对多种病原体具有有效的灭活作用，可灭活红细胞成分中的登革病毒（dengue virus，DENV）、ZIKV、基孔肯雅病毒（chikungunya virus，CHIKV）以及恶性疟原虫等。

有实验证明，第二代S-303 RBC在生理和代谢上均能够储存35天后进行输血，符合FDA关于RBC生存能力的指南[25-26]。其反应副产物的遗传毒性和致癌潜力已进行了评估，在体外或体内均未显示出遗传毒性，也不具有致癌性，不会诱导染色体畸变[27]。该技术的临床前病原体灭活研究、血清学评估、红细胞存活率评估等已经完成，目前已启动Ⅲ期临床疗效研究[26]。

2.3 PEN110法：PEN110是由美国VITEX公司开发出的一种INACTINE化合物，是一种化学上与二元亚乙基亚胺有关的化合物，被称为亚乙基亚胺低聚物。该分子小且具有高度的水溶性，因此很容易在细胞膜中扩散。PEN110中的取代烷基链通过与核酸的磷酸基团形成离子键发挥定位作用，通过氮杂环丙烷基团的质子化激活分子。然后，其活性形式可以使近端亲核中心烷基化，例如DNA中鸟嘌呤的N7位置。这导致鸟嘌呤的咪唑环结构打开，在链中产生断裂，核酸失去活性。

该化合物主要被用于红细胞浓缩液病原体灭活。研究证明使用PEN110可以灭活RBC中的产气荚膜梭菌、西尼罗病毒（west nile virus，WNV）、恶性疟原虫、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）、人巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）等多种病原体。但是，PEN110同S-303一样，具有轻微的毒性，所以需要在灭活后进行再次处理。

INACTINE技术在经过Ⅰ、Ⅱ期临床试验后，于Ⅲ期临床研究中发现受试者体内产生了针对PEN110 RBC的抗体。由于未找到好的解决方案，目前该技术的研发已被停止。

2.4 低温等离子技术：近几年低温等离子技术在灭活病原体中的应用逐渐发展成研究热点。据目前现有的报道，低温等离子技术不仅能够灭活病原体，还能促进细胞生长。

等离子体通常被称为物质的第四种状态，随着其能级的增加将其状态从固体最终转换为气体的“电离”状态，即“等离子体”。冷等离子体是在30～60℃的温度下产生的，没有热力学平衡[28]。由于低温等离子的处理是在室温下进行的，因此可以将对生物组织和不耐热基质的破坏作用降至最低，同时仍保持消毒和杀菌功效[29]。当前有各种类型的等离子体产生源，如辉光放电，射频放电，电晕放电，电介质阻挡层放电等。低温等离子会产生许多活性氧（ROS）和活性氮（RNS）[30]，例如过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）、臭氧 (O3)、一氧化氮（NO）和羟基自由基（·OH），以及电子、离子和光子，形成一种“活性物质混合物”，协同发挥对多种微生物的灭活作用，如孢子、病毒等[30-32]。低温等离子有两个主要影响：（一）损伤细胞壁/膜[33]。ROS、RNS可以使细菌细胞壁肽聚糖的C-O、C-N、C-C化学键断裂，破坏细胞壁对细菌的保护作用。ROS、RNS也会使细胞膜上的脂质、蛋白质氧化引起局部损伤。此外，电子和离子对细胞壁的轰击会破坏化学键，通过蚀刻造成腐蚀，在细胞膜上形成损伤和开口，导致低温等离子体进一步渗透到细胞内，引起细胞内大分子物质（蛋白质、DNA）、钾的泄漏。（二）活性物质（主要是单线态氧）损伤DNA和蛋白质，如DNA可能自身或与蛋白交联，碱基（尤其是鸟嘌呤）的氧化，蛋白质交联、蛋白质氧化降解等[34]。

该技术的一些优势是操作温度低、水的消耗少、耗时短、生产过程中没有化学残留以及成本低等优势。目前该技术广泛应用于减少食物腐败微生物，食源性病原体等方面[35-36]。正由于其有效、便捷、无毒无害，且能促进细胞生长等特点，或许对血液中各种细胞成分有帮助。但目前缺乏相关的实验证明该技术是否会破坏血液中的有效成分，需要进一步的研究。

2.5 飞秒激光/超短脉冲激光技术：使用超短脉冲激光进行选择性消毒已成为一种潜在的无化学方法，其作用机理是通过脉冲受激拉曼散射（ISRS）激发病毒衣壳内分子振动。

ISRS已被证明是在液体溶液中产生分子大振幅振动模式以及在固体系统中产生晶格振动的一种可行方法。YAN[37]等人证明ISRS是一个过程，通过这个过程，只要足够短的激光脉冲通过拉曼活性固体或分子液体或气体，就会激发相干晶格或分子振动。因此，在这个ISRS过程中，如果沉积在病毒颗粒衣壳上的激光能量或激发共振模式的振幅足够大，就会破坏蛋白质之间的薄弱环节（例如氢键或疏水接触），从而破坏病毒颗粒的衣壳，导致病毒失活。

超短脉冲激光对细菌的灭活机制有两方面：一是激光照射导致细菌中的超螺旋DNA发生松弛，使DNA损伤；二是激光照射刺激细菌中内源性卟啉分子产生活性氧（ROS），主要是单线态氧，从而导致DNA损伤和细菌死亡[38]。

研究人员证明了使用超短脉冲激光灭活人血浆中包膜和非包膜病毒的作用，可使血浆中的HIV、甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）、CMV的滴度下降[39]。且超短脉冲激光处理后人血浆蛋白的功能也得以保留，相对于对照样品，因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ显示≥90%的保留。因子Ⅻ和纤维蛋白原显示≥70%的保留。因子Ⅷ和Ⅺ是最敏感的，分别显示68%和54%的保留率。鉴于该技术的特性，使其具有以下优势：

（1）对包膜/非包膜病毒、DNA/RNA病毒以及细菌均有灭活效果。

（2）没有引入任何外来的化学物质，可以安全环保地减少病原体，将潜在的副作用降至最低。

（3）该技术不同于UV，不会破坏蛋白质和核酸内的共价键，不会影响血液中的有效成分，如血浆蛋白、凝血因子等[39]，并且降低了产生新抗原的可能性。

（4）该技术主要依赖于改变病毒结构来达到灭活的目的，对病原体核酸突变不敏感，因此可用于灭活野生型和突变/耐药菌株。

可见，超短脉冲激光技术代表了一种血液成分病原体灭活技术发展方向。

2.6 高静水压技术：高静水压技术是一种物理病原体减少技术，是指采用超过100 MPa的静态液压压力减少病原体，也称为超高压。

包膜病毒必须经过膜融合才能将其基因组传递到宿主细胞中。包膜病毒上介导融合的蛋白在天然非融合状态下处于亚稳态构象，通过动力学屏障与较低的自由能状态（融合构象）分开。当病毒-细胞相互作用触发融合时，屏障就会被超越。而超高压处理后病毒包膜蛋白的构象发生改变，疏水区域暴露，融合活性显著增强，病毒包膜由亚稳定状态向更稳定的膜融合状态转变[40]。即超高压处理包膜病毒，包膜稳定性增强，可以保护病毒衣壳，使病毒核酸无法释放，失去感染性。然而，无包膜病毒对超高压表现出不同的敏感性。脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV，HAV的模型病毒）在200 MPa压力下2 min即可轻松灭活，而猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV，人类细小病毒B19的模型病毒）对压力不敏感。有研究人员通过病毒蛋白和基因组RNA两方面探究超高压对轮状病毒（rotavirus，RV）的灭活机制，他们发现，超高压不能破坏RV的基因组RNA，但能破坏衣壳蛋白使病毒颗粒丧失完整性[41]。对于有些细菌而言，在一定压力下，蛋白质复合物的解离可能在细菌的生长抑制中起决定性作用，因为这些复合物中的许多都参与了基本的细胞过程，例如复制、转录和翻译[42]。目前该技术已被用于灭活食品中的病原体[43]。

高静水压技术同飞秒激光一样，也具有不引入任何化学物质的优势。此外，还具有操作简便、处理时间短和高通量的特点。这些优点使得该技术具有灭活血液成分中病原体的巨大潜力。该技术已在不同的条件下证实可使血浆中的HIV-1、伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）、EMCV的滴度降低[44-45]，也能使血浆中金黄色葡萄球菌失活[46]。此外，研究人员在对将高静水压技术用于血浆病原体灭活的探索中发现，压力大小、温度和循环频率等条件对病原体的灭活具有累加作用[47]。高静水压技术在灭活病原体的同时也会给凝血因子的活性带来一定的损失。虽然优化后的高静水压技术能有效稳定血浆中凝血因子的活性，保持蛋白质的含量，但如何平衡灭活效果和有效成分活性，还需要进一步的探究。

3 小结 多年来，由于献血者询问、筛查和血液病原体灭活技术等策略的引入，输血传播疾病的残余风险大幅下降，尤其是在发达国家。然而，在很多发展中国家，由于基础卫生条件较差，再加上经济条件的限制，无法负担先进但昂贵的血液筛查技术，使得输血传播疾病仍然严重威胁着血液安全。过去二十年出现的一些新发再发病原体，如中东呼吸综合征冠状病毒[48]（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV）、DENV[49]、SARS-CoV-2[50]等，研究人员通过使用PI技术同样能够将它们有效灭活，这也更加突出应用血液病原体灭活技术的必要性。目前，PI技术虽已得到了一些应用，但仍存在一定的局限性。总的来说，血浆和血小板的PI技术较为成熟，而针对红细胞和全血的灭活仍期待着更加成熟的技术，细小的无包膜病毒的灭活也存在挑战。此外，PI技术的应用成本也阻碍了一些发展中国家的使用。因此，PI技术的发展需要研发更加安全有效低成本的方法。低温等离子技术、飞秒激光、高静水压技术对多种病原体显示出的灭活作用和具有操作温度低、控制性强、不会引入有毒物质以及成本低等优势，使它们具有用于灭活血液成分中病原体的潜力，但目前缺乏大量相关的实验来揭示这些技术对血液中有效成分的影响，所以有待进一步的开发和研究。

病原体灭活技术相较以前已取得了显著进展，其对病原体的灭活作用也在血液成分中得到许多实验验证。这提示我们，病原体灭活技术在降低输血传播疾病方面具有非常重要的地位。

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