METTL7B 促进非小细胞肺癌细胞侵袭的机制研究

彭芳 赵盼 宋惠彬 刘东成 邹畅

1.深圳市人民医院健康管理中心 暨南大学第二临床医学院 南方科技大学第一附属医院，广东深圳 518020；2.深圳市人民医院临床医学研究中心 暨南大学第二临床医学院 南方科技大学第一附属医院，广东深圳 518020

肺癌是我国最常见的癌症，据最新统计数据显示，肺癌的发病率和病死率在我国男性中位居第一，在女性中位居第二。非小细胞肺癌（non–small cell lung cancer，NSCLS）是肺癌的主要亚型（约85%），每年全球新增肺癌病例仅次于乳腺癌，发病率高达11.4%，5 年生存率低于15%。在过去的10 年中，对肺癌基因组和信号通路的深入分析进一步将非小细胞肺癌定义为一组具有遗传和细胞异质性的不同疾病。在NSCLC 的治疗方面，靶向药物的出现为肺癌患者带来了全新的希望，但也仅有约40%患者携带符合靶向药物的基因突变，仍有一半左右的患者需接受传统化疗或其他方法进行治疗。甲基转移酶（methyltransferase–like，METTL）是一个多样化的蛋白质家族，其特征是存在甲基转移酶样结构域和结构上保守的S–腺苷甲硫氨酸（S–adenosylmethionine，SAM）结合结构域，有研究表明甲基化能直接影响染色质组织并调控基因转录，且不会使基因本身突变。此外，甲基转移酶在遗传疾病、癌症和代谢疾病的发展中发挥着关键的作用。甲基转移酶样蛋白–7B（methyltransferase–like 7B，METTL7B）是甲基转移酶样蛋白家族中的一员，近期有研究证明其与非小细胞肺癌的发生和发展有关，但其影响非小细胞肺癌的进展的机制尚不清楚，因此本文主要探讨METTL7B 促进非小细胞肺癌细胞侵袭的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人非小细胞肺癌细胞A549 购自中国cellcook 公司，DMEM 培养基购自美国Gibco 公司，胎牛血清购自美国Hyclone 公司，青霉素–链霉素购自上海麦克林生化科技有限公司，METTL7B 抗体购自英国Abcam 公司，Lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen公司，蛋白提取以及蛋白定量的试剂均购于美国Thermo 公司，PCR 引物购于中国广东艾基生物公司，提取总RNA 试剂、RT–qPCR 试剂盒均购自美国Invitrogen 公司。

1.2 实验方法

（1）细胞培养及转染：A549 细胞培养基为含10%胎牛血清的DMEM 培养基，培养于37℃，5%CO的细胞培养箱中。按照Lipofectamine 2000 转染试剂盒说明书将 METTL7B 过表达慢病毒载体（pLV–METTL7B–Flag）及阴性对照慢病毒载体（pLV–NC–Flag）感染A549 细胞，培养6h 后换无血清培养基培养48h，然后胰酶消化细胞，800g 离心5min，弃上清，收集细胞，备用。

（2）RT–qPCR 检测：A549 细胞和BEAS–2B细胞的总RNA 利用TRIzol 法提取获得，反转录为cDNA。METTL7B 引物序列：上游5’–CCAGATAAA GGGGCTTACAGGAG–3’，下游5’–TCAGCCATGCT CTTTGTCAGG–3’。依照RT–qPCR 说明书进行PCR反应，条件设为：95℃预变性10min，95℃、35s，62℃、35s，72℃、5min，连续40 个循环，每组设3个重复孔。分析RT–qPCR 的扩增及溶解曲线并计算目的基因的相对表达量=2。

（3）Western blotting 法检测：将METTL7B 过表达的A549 细胞和对照组收细胞并提取细胞总蛋白，利用BCA 试剂盒法测定蛋白浓度。上样蛋白量为50μg/孔，等量的蛋白质样品通过SDS–PAGE 上传和分离，然后电转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene，PVDF）膜上。膜是在室温下封闭在5%脱脂奶粉中1h，然后在4℃孵育过夜。然后将膜与室温下HRP偶联二抗1h。条带信号由ECL 试剂检测，以目的条带与内参β–actin 的比值作为半定量依据。

（4）Transwell 细胞侵袭实验：用0.25%的胰蛋白酶消化过表达METTL7B 的A549 细胞与对照组细胞，每孔加入1×10个/400μl 细胞于DMEM 无血清培养基中，将Transwell 小室放入24 孔板中，小室中加100μl 的细胞悬液，下室中加500μl 的细胞完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM），每组3 个重复孔。将细胞培养于37℃，5% CO细胞培养箱中24h，取出小室，PBS 洗2 次，棉签轻擦掉未迁移的上层细胞，迁移的细胞用4%的多聚甲醛固定30min，结晶紫染色，PBS 漂洗，干燥后，取5～10 个高倍镜视野观察并计数。

（5）双向电泳第一向电泳：取过表达MTTL7B的A549 细胞和未处理的A549 细胞混合蛋白，加样于pH 梯度干胶条上，再根据等电聚焦仪操作方法设置相关程序。第二向垂直电泳：十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰氨凝胶电泳胶浓度为12%，电泳条件为：50V，30min；300V，5h。重复3 次。并利用胶体考马斯亮蓝进行凝胶染色。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 METTL7B 在A549 细胞系中的表达

qPCR 和Western blotting 法分析结果一致，与BEAS–2B 细胞相比，A549 细胞系中METTL7B 表达显著升高（<0.05），详见图1A、B。

图1 METTL7B 在非小细胞肺癌细胞系中的表达

2.2 过表达METTL7B 对A549 细胞的侵袭作用

实验前，通过Western blotting 法验证了METTL7B在A549 细胞中的过表达情况，结果显示，METTL7B在A549 细胞中过表达成功，详见图2A。为了评估METTL7B 对非小细胞肺癌细胞的侵袭影响，进行侵袭试验，结晶紫染色24h 后统计分析进入小室的细胞量可以发现，A549–METTL7B 组侵袭细胞数量明显多于A549–NC 组（<0.05），即METTL7B 过表达可增强A549 细胞的侵袭能力，详见图2B、C。

图2 METTL7B 过表达对A549 细胞的侵袭作用

2.3 过表达METTL7B 非小细胞肺癌细胞中蛋白质组学分析

可获得分辨率和重复率较高的A549–NC 和A549–METTL7B 的蛋白2–DE 图谱，凝胶图谱中清晰可辨的有效蛋白点数平均分别为（813±21）个和（879±30）个，图谱两者匹配率为81%，详见图3A。

A549–NC 与A549–METTL7B 两组的2–DE 差异蛋白比较有12 个差异蛋白点，其中有6 个差异蛋白点在A549–METTL7B 细胞中表达上调，6 个差异蛋白点是表达下调，主要分布在25～63kDa，详见表1。另外进一步通过Western blotting 法实验验证发现上调的基因SOD1 和SAE1 在A549–METTL7B 细胞中高表达，详见图3C 与双向电泳分析结果一致，详见图3B。

表1 过表达METTL7B 非小细胞肺癌细胞中差异蛋白

图3 过表达METTL7B 非小细胞肺癌细胞中蛋白组分析

3 讨论

肺癌在全球是最常见的恶性肿瘤之一，也是男性发病率最高和癌症死亡的主要原因。近年来，随着环境污染及其他因素的恶化，肺癌发生率呈逐年上升趋势，但其发病机制非常复杂，导致其防治形势非常严峻。因此迫切需要确定特定的分子生物标志物，尤其是以前未被识别的分子，用于肺癌早期诊断及为肺癌的治疗提供新思路。METTL7B 是哺乳动物甲基转移酶样家族的一员，有研究表明甲基转移酶样家族的成员参与了各种生物学功能和在肿瘤发生中发挥重要作用。然而，METTL 家族其他成员在癌症发展中的作用在很大程度上仍未被探讨。

本研究对过表达METTL7B 影响非小细胞肺癌细胞侵袭机制进行了初步研究，结果表明，过表达METTL7B 可增强非小细胞肺癌的侵袭能力，并通过双向电泳技术分析了过表达METTL7B 细胞中差异蛋白，发现共有12 个差异表达蛋白，其中上调6个，下调6 个，并对上调差异蛋白的验证发现，过表达METTL7B 细胞中的SOD1 和SAE1 的表达也是上调的。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内减轻氧化应激损伤主要的抗氧化酶之一，具有捕获或中和自由基以阻止进一步氧化损伤的作用，因而也是ROS 清除的第一道防线。首次证实铜/锌超氧化物歧化酶（superoxide dismutase 1，SOD1）的酶促功能是在1969年。随后数十年的研究揭示了SOD1 生物学的几个关键方面，包括作为活性二聚体的SOD1 的结构，其必需的金属辅助因子（铜和锌）以及将超氧自由基转化为分子氧和过氧化氢的能力。在疾病背景下，SOD1 以其在家族性肌萎缩侧索硬化症（familial amyotrophic lateral sclerosis，fALS）中的作用而闻名，其中各种各样的SOD1 突变增加SOD1 聚集的倾向，这被认为最终诱导运动神经元死亡。此外，SOD1 在多种癌症中也被发现表达上调。Liu等研究发现SOD1 通过miR–409–3p/SOD1/SETDB1 正反馈环路促进非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭。Gomez等发现SOD1对于癌基因驱动的增殖至关重要，但与妊娠相关的乳腺或其他正常增殖组织（如皮肤和肠道）的正常增殖并非如此，且表明癌基因ErbB2 的激活与ROS 增加有关，且ErbB2 癌细胞的高ROS 亚群显示SOD1 升高。本研究发现，过表达METTL7B 细胞中SOD1 是上调的，与Song等最新研究表明在过表达METTL7B 的肺腺癌细胞系中SOD1 显著上调的趋势一致；其次，小泛素样修饰剂（small ubiquitin–like modifier，SUMO）是一种蛋白质修饰途径，可调节多种生物过程，包括细胞分裂、DNA 复制/修复、信号转导和细胞代谢。SUMO 通过由SUMO 特异性激活酶（E1）、缀合酶（E2）和连接（E3）酶催化的异肽键与靶蛋白中的赖氨酸残基缀合。SUMO 激活酶E1（SUMO–activating enzyme subunit 1，SAE1）属于泛素激活酶E1 家族成员，其前体包含101 个氨基酸，且具有一个灵活的NH末端，COOH 末端的4个氨基酸被SUMO 异肽酶切割，以揭示与靶蛋白的赖氨酸残基形成异肽键所需的保守二甘氨酸残基，其主要定位于细胞核，在很多组织中表达。SAE1 主要介导乙酰化修饰和磷酸化翻译修饰途径，在染色体分裂和细胞凋亡中发挥重要作用。有研究表明，SAE1 与肿瘤的发生发展密切相关，在肝癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤中均发现SAE1 有不同程度的表达上调。Ong等研究表明，SAE1 在肝癌组织中的过表达与正常癌旁组织相比，SAE1 高表达与疾病转移和进展密切相关且上调的SAE1 的致癌作用与失调的癌症代谢信号传导有关。本研究发现过表达METTL7B 细胞中SAE1 是上调的，与朱嘉微发现SAE1 在肺癌中表达上调结果趋势一致。因此，得出METTL7B 可能通过上调SOD1 和SAE1 的表达，从而增强非小细胞肺癌细胞的侵袭能力。