miRNA–193a–3p 靶向TGF–β2 基因诱导肝癌细胞凋亡的分子机制研究

鞠宝玲 海艳洁 鄂志野 张红军

1.牡丹江医学院免疫教研室，黑龙江牡丹江 157001；2.牡丹江医学院红旗医院肿瘤科，黑龙江牡丹江 157001

肝癌是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤，具有患病率高、转移性强的特点。目前临床上治疗肝癌主要采用手术切除、辅助化疗及靶向治疗等，但易复发和转移，预后较差，5 年生存率较低。研究表明，非编码小RNA 分子（microRNA，miRNA）作为癌基因或抑癌基因参与了肝癌的发生发展和转移过程，因此，探讨miRNA 在肝癌中发生、发展的相关分子机制，由此开发分子靶向治疗位点，对于提高肝癌的临床疗效具有重要意义。本研究选取2019 年1 月至2021 年12 月在牡丹江医学院红旗医院收治的肝癌患者30 例，分析了目标miRNA 在肝癌发生发展中的作用及其作为分子靶向治疗位点的可行性，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019 年1 月至2021 年12 月在牡丹江医学院附属红旗医院进行手术切除的肝癌患者30 例，其中男性18 例，女性12 例；患者年龄40～69 岁，平均年龄（55.62 ± 7.93）岁；TNM 分期I期8 例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期12 例；高中分化19 例，低未分化11 例，所有患者术前均未接受新辅助化疗，且临床资料完整。留取肝癌组织和相应癌旁正常组织（距离肝癌组织边缘2cm 以上，经病理确认无癌细胞浸润正常组织），手术取材后立即置于–80℃冻存备用。本研究经牡丹江医学院医学伦理委员会批准（伦理学审批号：20210304–50），所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 细胞培养

肝癌HepG2 细胞系购自美国ATCC 细胞库，HepG2 细胞株接种于含10%胎牛血清的DMEM（dulbecco's modification of eagle’s medium，DMEM）完全培养液，置于37℃，5% CO恒温箱中培养，待细胞贴壁生长至 70%～80%融合度时进行实验。miR–193a–3p mimic 及无义miRNA（对照NC 组）、TGF–β2 过表达质粒及空质粒，稀释至100nmol/L，采用Lipofectamine 2000 转染试剂转染6h，更换培养液，继续培养48h。实验分组：miR–193a–3p mimic组和对照NC 组、miR–193a–3p mimic+空质粒组和miR–193a–3p mimic+TGF–β2 组。

1.3 miR-193a-3p 靶基因预测及双荧光素酶报告实验验证

采用TargetScan（http：//targetscan.org/）和miRDB（http：//mirdb.org/miRDB）靶基因预测网站预测miR–193a–3p 靶基因。构建TGF–β2 野生型质粒（TGF–β2–wild type，TGF–β2–Wt）和TGF–β2 突变型质粒（TGF–β2–mutant，TGF–β2–Mut），将质粒与miR–193a–3p mimic 共转染至细胞，48h 后，分别测定细胞萤火虫荧光素酶荧光强度（M1）以及内对照海肾荧光素酶荧光强度（M2），实验数据以荧光强度（M1）/荧光强度（M2）表示。

1.4 miR-193a-3p 检测

采用实时荧光定量PCR（real–time quantitative PCR，qRT–PCR）检测肝癌组织中miR–193a–3p 水平。Trizol 提取肝癌组织及癌旁正常组织中总RNA，反转录成cDNA，SYBR Green 法检测miRNAs 的表达，引物序列如下：miR–193a–3p，上游引物：5′–CGC GAA CTG GCC TAC AAA GTG–3′，下游引物：5′–AGT GCA GGG TCC GAG GTA TT–3′；U6，上游引物：5'–CTC GCT TCG GCA GCA CA–3′，下游引物：5'–AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT–3′。反应条件：95℃预变性15min，94℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，共40 个循环。每个样本设3 个复孔，采用2法计算。

1.5 HepG2 细胞活性的检测

采用CCK–8 实验检测HepG2 细胞活性。调整HepG2 细胞浓度为1×10/L，接种于96 孔板。细胞施加不同作用因素后培养48h，弃去培养液，每孔加入90μl DMEM 培养液和10μl CCK–8 试剂，充分混匀，培养箱中孵育4h，于酶标仪450nm 波长处测定各孔吸光度值。

1.6 HepG2 细胞凋亡的检测

细胞施加不同作用因素后培养48h，以预冷PBS洗涤细胞并调整细胞密度为10～10/ml，加入5μl的Annexin V–FITC 避光孵育10min，再加入10μl 的碘化丙啶，低温避光孵育15min，1h 内应用流式细胞仪检测HepG2 细胞凋亡率。

1.7 HepG2 细胞迁移的检测

采用Transwell 侵袭实验检测HepG2 细胞的迁移。实验前将HepG2 细胞饥饿24h，收集细胞，以无血清培养基调整细胞密度为3×10个/ml，取300μl细胞悬液置于Transwell 小室（6.5mm，8.0μm 孔径，Corning）上室，下室加入750μl 含20%胎牛血清的完全培养液（去除下室培养液和小室之间气泡），培养24h。甲醛固定侵袭的细胞，10%结晶紫对贴壁细胞进行染色，显微镜下计数，评估HepG2 细胞的迁移能力。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 miR-193a-3p 在肝癌组织中的表达

qRT–PCR 结果显示，肝癌组织中miR–193a–3p 的表达（0.27±0.03）显著低于正常肝脏组织（0.69±0.06），差异有统计学意义（<0.01），详见图1。

图1 肝癌组织中miR-193a-3p 的表达

2.2 miR-193a-3p 过表达对肝癌细胞生物学功能的影响

与NC 组比较，miR–193a–3p 组细胞的增殖活性及迁移数量减少，细胞凋亡率显著增加，差异有统计学意义（<0.05），且以时间依赖性方式诱导肝癌细胞凋亡，详见表1 和图2A、B。

图2 HepG2 细胞的迁移和凋亡检测

表1 两组细胞的增殖活性、迁移及凋亡率比较（）

2.3 miR-193a-3p 下游靶标的确定

取TargetScan 与miRDB 两个数据库预测的靶基因交集，进行GO 分析（功能富集分析）和Pathway分析（信号通路分析），结果提示：miR–193a–3p 可能与转化生长因子–β（transforming growth factor，TGF–β）、MAPK 信号通路（mitogen–activated protein kinase，MAPKs）、序列相似家族（family with sequence similarity，FAMs）以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）通路有关（表2），其中与TGF–β、MAPKs 通路相关的可能性最大（Pathway分析，<0.0001）。qRT–PCR 结果发现，miR–193a–3p可显著抑制TGF–β2 基因的表达，而对TGF–βR 和MAPK10 通路中预测靶标的影响不大（图3A），提示TGF–β2 可能是miR–193a–3p 的下游靶标：荧光素酶报告系统结果显示：miR–193a–3p 过表达可显著抑制TGF–β2 3’UTR 报告系统的荧光素酶活性（图3B）：进一步生物信息学分析显示，miR–193a–3p与靶基因TGF–β2 的互补结合序列在进化上高度保守（图3C）。

表2 miR-193a-3p 靶基因生物信息学分析

图3 miR-193a-3p 下游靶基因TGF-β2 的确证分析

2.4 miR-193a-3p/TGF-β2 轴对肝癌细胞生物学功能的影响

与miR–193a–3p+空质粒组比较，miR–193a–3p+TGF–β2 组肝癌细胞的增殖活性及迁移数量增多，细胞凋亡率显著减少，差异有统计学意义（<0.05），详见表3 和图4A、图4B。

表3 两组细胞的增殖活性、迁移及凋亡率比较（）

图4 HepG2 细胞的迁移和凋亡检测

3 讨论

miRNAs 为19～26 个核苷酸的短RNA 分子，通过负向调节靶基因的mRNA 表达或直接抑制其蛋白质翻译，参与调控细胞周期、增殖、凋亡和迁移等生理病理过程。肝癌因其病灶血供丰富，癌细胞增殖、迁移、侵袭能力极强，导致肝癌是预后较差的恶性肿瘤，因此，寻找更多肝癌细胞增殖、侵袭、转移的相关靶点对临床肝癌的靶向治疗具有重要意义。研究发现，miRNA 通过靶向与肿瘤细胞周期、细胞增殖有关的基因或与细胞侵袭、细胞迁移有关的基因，参与肝癌的发生、发展、转移及血管生成。如在索拉菲尼耐药的肝癌细胞中上调miRNA–200b，通过靶向调控Ras 同源基因家族蛋白A（rhoA protein，RhoA）的表达，进一步抑制肝癌细胞的侵袭和转移。miR–3188 上调表达于肝癌组织，过度表达的miR–3188通过靶向调控CXCL14调节肝癌细胞的生长和凋亡，有望成为肝癌早期筛查和诊断的分子标志物。过表达miR–1470 通过靶向调控ALX4 基因具有促进肝癌细胞的增殖、抑制肝癌细胞凋亡的作用。本研究结果显示，30 例肝癌组织中miR–193a–3p的表达显著低于癌旁正常组织，且体外细胞功能实验显示：miR–193a–p mimic 抑制HepG2 细胞活性和迁移，同时过表达miR–193a–3p具有显著诱导HepG2细胞凋亡的作用。

有文献报道显示，miR–193a–3p 在肿瘤发生、发展中的作用具有争议性，其在不同肿瘤中发挥着“癌基因”或“抑癌基因”的调节作用，如miR–193a–3p低表达于非小细胞肺癌中，miR–193a–3p 作为肿瘤抑制因子，通过调控p53/Slug/L1CAM 途径抑制非小细胞肺癌的迁移进展：而在对胃癌细胞的研究中显示，下调miR–193a–3p 通过靶向调控PTEN 基因抑制肿瘤的增殖、迁移和化疗耐受效应。但有关miR–193a–3p 与肝癌的研究却报道较少，本研究表明，miR–193a–3p 作为肿瘤抑制因子，具有以时间依赖性方式诱导肝癌细胞的凋亡作用，但其潜在的作用机制仍需要进一步探讨。通过生物信息学分析的方法提示TGF–β2 是miR–193a–3p 的下游作用靶标，文献复习发现，TGF–β2 通过诱导肝癌细胞自噬，抑制ROS 产生，进一步诱导上皮–间充质转化。有文献报道，RALYL 作为肝癌干细胞的特异性基因通过维持TGF–β2 mRNA 的稳定性来调节肝癌干细胞的生物学功能，因此TGF–β2 是肝癌干细胞维持生物学性状的重要基因。本研究显示，TGF–β2 过表达显著反转了miR–193a–3p抑制肝癌细胞的活性和迁移，减少了miR–193a–3p 诱导的HepG2 细胞的凋亡作用。因此，本研究有充分的理由证实，miR–193a– 3p在肝癌细胞发生、迁移和侵袭中作用，是通过靶向TGF–β2 基因的表达而发挥肿瘤抑制功能。

综上所述，过表达的miR–193a–3p 可通过靶向调控TGF–β2 基因的表达，抑制肝癌细胞的活性和迁移，同时具有显著促进肝癌细胞凋亡的作用，因此，本研究为miR–193a–3p 有望成为肝癌靶向治疗的潜在分子靶标提供新的思路和理论依据。