肺炎支原体肺炎患儿外周血miR-29c、miR-146a与炎症因子的相关性研究

孙玉军，马敬斌，马海凤

(聊城市第二人民医院儿科，山东 聊城 252600)

肺炎支原体肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)是儿童肺炎常见类型，在儿童社区获得性肺炎中占比约10%～30%。MPP可进一步发展为重症MPP，出现肺脓肿、肺不张等肺内并发症，或累及神经、心血管、消化等肺外系统，危及患儿健康与生命[1]。然而，MPP前期症状缺乏特异性，临床常规病情评估体系可能存在一定的滞后性，从而影响患儿的及时治疗[2]。因此，探寻MPP的早期客观指标以辅助临床评估，对及时干预治疗、改善预后至关重要。近年来，微小RNA(microRNA，miRNA)逐渐被证实参与许多生物学过程[3]。相关研究表明微小RNA-29c(microRNA-29c，miR-29c)、微小RNA-146a(microRNA-146a，miR-146a)与哮喘、病毒性肺炎等儿童呼吸系统疾病的发生发展有关[4-5]；动物实验研究也表明miR-146a可调节炎症因子参与MPP发展[6]。鉴于炎症反应是目前公认的MPP重要发病机制，既往研究也证实炎症因子与MPP儿童密切相关但受到多因素影响[7]，故本研究结合miR-29c、miR-146a与炎症因子相关性的分析，探讨二者与MPP的关系，旨在为临床防治提供依据。

1资料与方法

1.1研究对象

本研究为前瞻性研究，选取2018年5月至2020年10月于本院诊治的96例MPP患儿为MPP组对象，纳入标准：①MPP诊断符合《诸福棠实用儿科学(第8版)》中标准[8]；②患儿年龄3～12岁；③MPP急性期入院；④患儿家属知情同意。排除标准：①入院7d内出现其他细菌或病毒感染；②伴其他呼吸系统疾病(哮喘、肺结核等)；③免疫、血液系统疾病及皮肤病、全身过敏性疾病患儿；④近3个月有免疫抑制剂、糖皮质激素、抗凝药物应用史；⑤心、肝、肾、肺等器质性疾病及结缔组织病患儿。另选取同期住院且明确诊断为细菌性肺炎的69例患儿为细菌性肺炎组；同期于本院体检健康的87例儿童作为健康对照组(年龄3～12岁，排除近6个月有感染疾病史者及血液、免疫相关疾病儿童)。本研究符合《赫尔辛基宣言》要求，获得院医学伦理委员会批准，研究对象的家属均知情同意。

1.2研究方法

1.2.1外周血miR-29c、miR-146a水平检测

急性期MPP、细菌性肺炎患儿入院后12h内采集静脉血3mL(采血前均未使用抗生素、免疫抑制剂、糖皮质激素治疗)，健康儿童于体检当天采血3mL，EDTA-K2抗凝，淋巴细胞分离液分离后加入TRIZOL-80℃存留备测。采用实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法测定外周血miR-29c、miR-146a相对表达量水平：①提取总RNA，测定RNA含量，反转录合成miR-29c cDNA、miR-146a cDNA，试剂供自日本TAKARA公司。②采用7500 FAST型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)对miR-146a、miR-29c、U6(内参)实施扩增。反应体系：SYBR Green Mix=10μL，上游引物=0.5μL，下游引物=0.5μL，cDNA=1μL，Distillation-Distillation H2O=8μL，总体积=20μL。扩增引物序列：miR-29c上游引物序列为GGGTAGCACCATTTGAAA，下游序列为GGGCAATTGCACTGGATAC；miR-146a上游引物序列为CTGGACTGCAAGGAGGGGTC，下游序列为GCAGACTGAAAAAGTTCTT；U6上游引物序列为ATTGGAACGATACAGAGAAGATT，下游序列为GGA ACGCTTCACGAATTTG。扩增反应条件：95℃预变性1min，95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸15s，共40个循环。各反应重复3次，以U6为内参，通过2-△△Ct计算外周血miR-29c、miR-146a相对表达量。

1.2.2炎症因子水平检测

采集研究对象入院后12h内(急性期MPP、细菌性肺炎儿童为入院治疗前，健康对照组儿童采血时间为体检当日)静脉血3mL，采血1次，离心10 min(3 000 r/min)取上清液，通过酶联免疫吸附试验测定血清白介素-17(interleukin-17，IL-17)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1beta，IL-1β)水平，试剂供自武汉博士德生物工程有限公司，所有操作严格按步骤遵循试剂盒说明完成。

1.2.3 MPP病情判定

依据《诸福棠实用儿科学(第8版)》中标准[8]，确诊MPP患儿如出现以下“①、②、③”中任2条和(或)“④、⑤”中任1条则判定为重症MPP：①接受规范大环内酯类药治疗>7d仍无效，或发热持续>10d；②心动过速或气促明显(1～5岁和>5岁患儿心率分别为≥140次/min、≥120次/min；呼吸频率分别为≥40次/min、≥30次/min)，可伴发绀、鼻扇、血压降低(收缩压≤75 mmHg)等；③胸部影像提示大片状致密影，占据≥1个肺叶/肺段，可累及单叶/多叶病变；④存在肺脓肿、肺不张等肺内合并症；⑤发生严重的低氧血症(氧分压<60 mmHg)，或出现心力衰竭、微循环紊乱、中枢神经系统感染等肺外并发症。根据是否发生重症MPP将96例MPP患儿分为重症组(n=45)和轻症组(n=51)。

1.3观察指标

观察各组儿童外周血miR-29c、miR-146a水平及IL-17、TNF-α、IL-1β水平；分析miR-29c、miR-146a与炎症因子相关性；比较MPP不同病情组患儿的miR-29c、miR-146a水平。

1.4统计学分析

2结果

2.1三组儿童基线资料的比较

三组儿童性别、年龄、年龄组、体质指数等基线资料间的差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 三组儿童基线资料的比较

2.2三组儿童外周血miR-29c、miR-146a及炎症因子水平比较

三组儿童外周血miR-29c、miR-146a水平的差异均有统计学意义(F值分别是117.929、87.687，P<0.05)，MPP组<细菌性肺炎组<健康对照组。三组儿童炎症因子IL-17、TNF-α、IL-1β水平的差异均有统计学意义(F值分别是129.282、107.023、386.649，P<0.05)，MPP组>细菌性肺炎组>健康对照组，见表2。

表2 三组儿童外周血miR-29c、miR-146a及炎症因子水平比较

2.3 MPP患儿外周血miR-29c、miR-146a与炎症因子的相关性

Pearson相关分析显示，MPP患儿外周血miR-29c、miR-146a与炎症因子IL-17、TNF-α、IL-1β均呈负相关(rmiR-29c分别是-0.512、-0.550、-0.494，rmiR-146a分别是-0.329、-0.282、-0.340，P<0.05)，见表3及图1。

表3 MPP患儿外周血miR-29c、miR-146a与炎症因子的相关性

图1 MPP患儿外周血miR-29c、miR-146a与炎症因子的相关性

2.4 MPP不同病情组外周血miR-29c、miR-146a水平比较

MPP重症组患儿miR-29c和miR-146a水平均低于轻症组患儿，差异有统计学意义(t值分别是3.477、3.453，P<0.05)，见表4。

表4 MPP不同病情组外周血miR-29c、miR-146a水平比较

3讨论

3.1MPP与炎症因子的关系

本研究发现，MPP组患儿的IL-17、TNF-α、IL-1β水平均明显高于细菌性肺炎组和健康对照组儿童。IL-17分泌自Th17促炎细胞，可经中性粒细胞招募性刺激多类炎症介质释放，在MPP中水平增高。既往研究也表明急性期MPP的IL-17水平相比正常者升高，且在合并肺外并发症组中升高显著[9]。MPP可刺激巨噬细胞释放TNF-α，过量TNF-α可诱发免疫损害、内皮细胞损伤，继而参与肺外系统受损，因此TNF-α与MPP病情有关。既往临床研究及动物实验均表明TNF-α有助于MPP评估[10-11]。IL-1β是主要分泌自巨噬细胞的促炎因子，可影响免疫应答、细胞增殖、感染过程等。蔡辰等人研究表明重症MPP组血清IL-1β相比非重症MPP组高[12]，说明IL-1β可反映MPP病情。

3.2研究MPP客观标志物的必要性及意义

MPP发生过程可激活免疫细胞，促使大量炎症因子释放，参与MPP发展。但炎症因子受到多因素调节和影响，对MPP儿童病情的反映可能存在滞后性，加之MPP病因机制复杂，目前临床对客观指标的探寻尚不全面。蔡辰等[12]研究也指出，细胞因子水平对重症MPP缺乏诊断效能，在临床应用中难以预测重症MPP。因此，探寻更多潜在标志物辅助临床MPP的客观评估，从而为MPP的防治提供导向，具有重要研究意义。

3.3 MPP患儿miR-29c表达及与炎症因子的相关性

miR-29c在机体免疫应答、感染疾病中有重要意义。Zhang等人研究发现与对照组相比，哮喘加重患儿的miR-29c水平明显降低[13]；另有资料显示miR-29c在呼吸系统疾病的病理生理过程中参与作用[14]。然而miR-29c与MPP的相关研究尚少。本研究显示MPP患儿外周血miR-29c水平低于细菌性肺炎组和健康对照组，且MPP重症组低于轻症组，说明miR-29c在MPP患儿中呈相对低水平，且与MPP病情有关。这可能与miR-29c调控T细胞分化，调节抗感染免疫反应等有关[15]。既往研究表明，MPP感染患儿免疫功能紊乱，Th1细胞受抑制，Th1/Th2丧失平衡[16]；此外，Li等人[17]的研究显示与对照组相比，MPP患儿的miR-29c水平明显降低，而可溶性B7-H3、IL-17水平明显升高；B7-H3是miR-29c的直接靶标，miR-29c沉默会上调B7-H3的表达，因此miR-29c可能是防治MPP的新靶标。这可能是miR-29c水平可反映MPP患儿病情的重要原因。本研究相关性分析显示miR-29c与IL-17负相关，与上述发现较为一致。

3.4 MPP患儿miR-146a表达及与炎症因子的相关性

miR-146a是核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通道依赖型的具有抗炎特性的miRNA。既往研究表明miR-146a与呼吸窘迫综合征、急性肺炎等呼吸系统疾病具有关联性[18-19]。本研究显示MPP患儿的miR-146a水平低于细菌性肺炎组和健康对照组，且MPP重症组低于轻症组，说明MPP患儿miR-146a呈相对低水平，且与MPP病情有关。究其原因，miR-146a可抑制Toll样受体4调节的诱导型一氧化氮合酶，提高M2基因表达，减少巨噬细胞促炎因子的释放[20]；而低miR-146a水平预示机体抵抗能力和抗炎作用减弱，宿主反应失调，炎症及免疫损害增加，进而参与病情进展。Li等人[21]研究表明难治性MPP中miR146a5p的表达降低，可诱导ATP结合盒亚家族G成员1和白介素1受体相关激酶1的蛋白质表达，与MPP发展有关。另一方面，研究显示miR-146a可负性调控IL-1β等介导的白介素-6、环氧化酶-2的负性影响及炎症反应[22]。这可能是miR-146a与MPP相关联的机制之一，同时提示miR-146a与IL-1β等炎症因子存在关联性。国内报道显示miR-146a与TNF-α、IL-1β呈负相关[23]；本研究也发现miR-146a与IL-17、TNF-α、IL-1β均呈负相关，间接提示了miR-146a监测的可行性及价值。国外一项研究也表明社区获得性肺炎入院时高水平的miR-146a与较低的30天死亡率相关，可作为预后生物标志物[24]，但具体方案有待进一步实验明确。

综上所述，MPP儿童外周血miR-29c、miR-146a呈相对低水平，且与IL-17、TNF-α、IL-1β呈负相关关系；miR-29c、miR-146a可能参与MPP发病过程，其水平随病情加重而降低。但本研究属于单中心研究，样本量不大，后续尚待大样本量研究进一步予以验证。