人参皂苷Rg3通过调控PXN-AS1促进肺癌放射增敏的机制探讨*

黄 琳 李 彬 胡作为△

武汉市第一医院1肿瘤科，2甲乳外科，武汉 430022

肺癌是中国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，放射治疗是临床上治疗肺癌的主要手段，无论是在新辅助治疗、术后辅助治疗以及晚期姑息治疗阶段，放射治疗发挥着重要的作用；其主要是通过电离辐射诱导细胞核DNA损伤，促进肿瘤细胞的凋亡[1]。随着放射物理学的飞速发展，从二维放疗发展到目前的三维适形放疗和调强放疗，肺癌放疗疗效明显提高。但是由于周围正常组织尤其是心脏、肺组织、脊髓等对放疗剂量的限制，肿瘤的异质性以及某些肺癌细胞存在放射抵抗性，限制了肺癌放射治疗的效果。因此，积极探索肺癌的放射敏感性机制，寻找肺癌的放射增敏药物具有重要意义。人参皂苷Rg3是存在于人参中的一种微量四环三萜皂甙，药理学研究[2-3]表明，人参皂苷具有选择性抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移的作用。还有研究[4]表明，人参皂苷Rg3可以通过下调PD-L1的表达来提高放射敏感性和免疫功能。近年来，以长链非编码RNA(long noncoding RNA，LncRNA)为代表的肿瘤表观遗传学研究取得了革命性进展，LncRNA被认为可以影响包括增殖、凋亡、DNA损伤修复、代谢、细胞周期和放射敏感性在内的几乎所有肿瘤生物学特征[5]。LncRNA PXN-AS1是近几年刚发现的一种癌基因，已经有研究[6]表明，PXN-AS1可以促进肝细胞癌的化疗抵抗，并被发现是胰腺癌的抑癌基因，但其在肺癌细胞中的作用机制尚不明确。本研究通过选择肺癌细胞株，探究人参皂苷Rg3对肺癌细胞放射敏感性的影响及调控LncRNA PXN-AS1表达的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及药物

肺癌细胞株(A549、H466、H1299、H522)购自中科院上海细胞研究所。人参皂苷Rg3购自南京春秋生物工程有限公司，纯度95%，CAS号14197-60-5，用二甲基亚砜(DMSO)助溶后再将人参皂苷Rg3用细胞培养液(RPMI1640)稀释到1×10-6mol/L，于-20 ℃冻存。

1.2 主要试剂与仪器

RPMI1640培养液购自美国Gibco公司；荧光定量PCR试剂盒购自大连Takara公司；引物由华大基因合成；Trizol总RNA提取试剂购自北京TIANGEN公司；胎牛血清购自上海BI公司；八肽胆囊收缩素(CCK-8)试剂盒购自碧云天生物技术公司。干燥箱、培养箱购自上海润度生物科技有限公司；离心机、多孔培养板、移液器购自上海菌淼分离技术有限公司；酶联免疫检测仪、酶标仪购自上海同进基因科技有限公司。

1.3 细胞培养

肿瘤细胞培养于DMEM培养基中(培养基中含10%胎牛血清和青链霉素双抗)，培养条件为温度37 ℃、含5% CO2。待细胞进入对数生长期，用胰酶消化后选取2 mL细胞悬液并接种到6孔板中(保持细胞密度为1×105个/mL)用于下一步实验。

1.4 CCK8实验

对于CCK8分析，在100 mL的DMEM中，每孔2×103个细胞接种到96孔板中。在指定的时间点，采用CCK-8试剂盒在OD 450 nm处绘制增殖曲线。

1.5 克隆形成实验观察人参皂苷Rg3的放射增敏作用

取对数生长期肺癌细胞(A549、H1299)制备成单细胞悬液，分为研究组和对照组。研究组用人参皂苷Rg3处理(浓度为10 mmol/L)，将2种细胞消化，0及2 Gy种2500、4及6 Gy种3000、8及10 Gy种4000个细胞/培养皿中，24 h后细胞贴壁，予以X射线照射0、2、4、6、8、10 Gy，剂量率为2 Gy/min，每个剂量组设3个平行样，培养14 d后，弃去培养基、PBS冲洗、甲醛固定、Giemsa染色30 min、PBS冲洗后晾干，显微镜下计数含50个细胞以上的细胞集落。贴壁率(plating efficiency，PE)=(对照组集落数/细胞种植数)×100%；存活率(surviving fraction，SF)=实验组集落数/(细胞种植数×贴壁率)。实验结果采取多靶单击模型拟合数据并绘制克隆形成曲线。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

选取肿瘤细胞并培养至对数生长期，用PBS清洗后均匀地混合A549、H1299细胞与500 μL预冷的结合缓冲液和5 μL Annexin-V-FITC，避光放置15 min，上机前5 min加入2.5 μL PI溶液进行染色，均匀混合后上流式细胞仪检测细胞凋亡率。所有操作依照Annexin V-FITC/PI试剂说明书进行。

1.7 荧光定量PCR检测PXN-AS1的表达

采用Trizol试剂提取肺癌细胞总RNA，随后进行逆转录反应制备cDNA。荧光定量PCR检测方法以U6和GAPDH作为内参照，按荧光定量试剂盒说明书建立PCR反应体系(包括2 μL cDNA、10 μL SYBR Green Mix、上下游引物)。PCR运行参数设置为95 ℃ 3 min，然后进行下列反应：92 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，一共进行35个循环。PCR检测结果采用2-ΔΔCt法进行汇总分析。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 人参皂苷Rg3对肺癌细胞具有放射增敏作用

采用克隆形成实验验证人参皂苷Rg3对肺癌细胞A549以及H1299的放射增敏作用。结果显示，人参皂苷Rg3能够明显降低肺癌细胞的克隆形成率(P<0.05)。见图1。

图1 人参皂苷Rg3对肺癌细胞克隆形成率的影响

2.2 人参皂苷Rg3可以促进肺癌细胞凋亡

流式凋亡检测的结果显示，相比对照组，研究组加用了人参皂苷Rg3后，肺癌细胞A549以及H1299的细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。见图2。

图2 人参皂苷Rg3对肺癌细胞凋亡率的影响

2.3 PXN-AS1在肺癌中的表达及临床意义

荧光定量PCR检测结果显示，相比正常对照组织，PXN-AS1在肺癌细胞中的表达明显升高(P<0.05)。见图3A。

对4种肺癌细胞中PXN-AS1的表达进行了检测，结果显示，PXN-AS1在肺癌细胞中的表达均明显高于正常细胞(P<0.05)。见图3B。

利用生信数据库查询得到，高表达PXN-AS1的患者，其预后要明显差于PXN-AS1低表达的患者(P<0.05)。见图3C。

图3 PXN-AS1在肺癌中的表达

2.4 人参皂苷Rg3可以下调PXN-AS1的表达

加入人参皂苷Rg3后，利用荧光定量PCR对PXN-AS1的表达进行了检测，结果显示，研究组PXN-AS1的表达均发生了明显下调(P<0.05)。见图4。

图4 2组细胞PXN-AS1水平比较

3 讨论

在我国肺癌发病率和死亡率均占据所有恶性肿瘤的首位[7]，放射治疗是贯穿肺癌患者各个阶段的重要治疗手段。然而，放射治疗通常受到周围正常组织的剂量限制以及肺癌细胞对放射治疗的抵抗性等多种因素影响，从而导致治疗效果降低。临床常用的放射增敏剂有同步化疗增敏、抗血管靶向治疗增敏、免疫检测点抑制剂增敏等，但大多价格昂贵或副反应较大。中药的抗肿瘤作用日益被大家所关注，有研究表明，姜黄素可以调高鼻咽癌的放射治疗效果[8]，姜黄素可以通过减少DNA损伤的修复来提高直肠癌的放射敏感性[9]。因此，积极寻找可以提高肺癌细胞放射敏感性的中草药，对于提高肺癌的放射治疗效果具有重要的临床意义。

人参皂苷Rg3是从中药材人参中分离出来的四环三萜皂苷，有抗肿瘤的作用[10]。人参皂苷Rg3通过抑制血管内皮细胞增殖及迁移、抑制血管内皮生长因子活性及其信号传导来发挥抗肿瘤作用，此外还具有抑制血管外基质降解等抑制肿瘤血管生成的作用[11]。本研究进行克隆形成实验，结果显示人参皂苷Rg3能够明显降低肺癌细胞的克隆形成率，验证了人参皂苷Rg3对肺癌细胞的放射增敏作用。细胞凋亡和DNA损伤修复是影响放射敏感性的重要因素，表型研究也表明，相比对照组，加用了人参皂苷Rg3后，肺癌细胞的细胞凋亡率和DNA损伤明显增加，结果显示人参皂苷Rg3可以增加肺癌细胞的细胞凋亡和DNA损伤，这一结果与人参皂苷Rg3具有放射增敏作用的结果相一致。研究结果提示，人参皂苷Rg3对肺癌细胞具有放疗增敏作用。

有研究表明，LncRNA可以影响肿瘤细胞的放射敏感性。例如，LncRNA CYTOR可以下调肺癌细胞对放疗的敏感性，并抑制肿瘤细胞的凋亡[12]。本研究中，利用GEPIA数据库查询PXN-AS1在肺癌细胞中的表达，结果显示，相比正常对照组织，PXN-AS1在肺癌细胞中的表达明显升高；使用荧光定量PCR对4种肺癌细胞中PXN-AS1的表达进行了检测，结果显示，PXN-AS1在肺癌细胞中的表达明显高于正常细胞，且高表达PXN-AS1的患者，其预后要明显差于PXN-AS1低表达的患者。以上结果提示，PXN-AS1在肺癌细胞和组织中高表达，且与肺癌患者的预后呈负相关，PXN-AS1可能是一个肺癌相关的癌基因。在加用人参皂苷Rg3后，PXN-AS1的表达发生明显下调，这一结果表明人参皂苷Rg3可能通过调控PXN-AS1的表达来增加放射敏感性。

综上所述，人参皂苷Rg3可能是潜在的放射增敏剂，可能通过调控PXN-AS1促进肺癌细胞的放射增敏。然而本研究仅从体外细胞实验水平分析了人参皂苷Rg3对肺癌细胞放射治疗的影响，下一步还需进一步在分子水平及信号转导通路层面探讨人参皂苷Rg3在肺癌放射治疗中的作用和机制，以期为临床治疗提供新的思路。