白桦Trihelix家族全基因组鉴定及抗病表达模式分析

宁小萌，孙晶晶，冯思雨，李天骄，任占辰，李然红

(牡丹江师范学院 生命科学与技术学院，黑龙江牡丹江 157012)

白桦(Betulaplatyphylla)为桦木属落叶乔木，也被称为亚洲白桦、西伯利亚白桦，主要分布于中国东北地区，是一种具有重要应用价值的树种[1]。白桦在生长发育过程中常遭受到许多病原菌的侵害，如立枯病、叶枯病、根腐病等。立枯病严重危害处于生长期的幼苗，致死率达到30%～60%[2]；叶枯病是一种叶部病害，能使叶片产生大量坏死性病斑，导致叶片枯萎甚至提前脱落，致使大量苗木死亡[3]；根腐病主要危害植株根部，使植株底部叶片发黄脱落，植株产生矮化现象，最后整株叶片死亡[4]。化学农药是防治白桦病害的有效措施，但副作用也尤为明显，会对生态环境造成不可逆转的破坏。白桦抗病品种的培育，可减少白桦病害的发生，并可避免农药使用的不良影响，因而成为重要的研究课题。

转录因子是某些能和基因的特定序列专一结合从而保证目的基因能够以特定的强度在特定的时间和空间表达的蛋白质分子，也被称为反式作用因子，在植物的生长发育及对外界环境的反应中发挥着重要作用[5-6]。Trihelix家族是植物特有的转录因子家族[7]，其特点是在DNA结合域中含有一个典型的螺旋-环-螺旋-环-螺旋的三螺旋结构[8]，该结构域可以特异地与DNA序列中的光响应所需的GT元件结合，所以该家族也被称为GT家族[9]。在早期研究中，Trihelix家族功能主要与光反应调节有关[10]，近些年，Trihelix家族的其他生物学功能逐渐被发现，它们能够调控一系列植物器官如胚胎、气孔、种子及花的发育过程[11-15]，更重要的是它们能对植物中不同的非生物及生物胁迫做出反应，如OsGTγ1可以被盐胁迫强烈诱导，过表达该基因的水稻(Oryzasativa)耐盐性有所增强[16]。大豆(Glycinemax)GmGT2A和GmGT2B在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中过表达，转基因拟南芥对盐、冷冻和干旱胁迫的抗性提高，且GmGT2B会赋予转基因植株对ABA的耐受性[17]。在大豆受到丁香假单胞菌番茄致病变种 DC3000(Pseudomonassringaepv.tomato)的侵染30 min内，SCaM-4的转录被迅速诱导，经验证发现GT-1顺式作用元件是该基因的核心顺式作用元件，GT-1-like转录因子——AtGT-3b也能与该顺式作用元件结合，并在NaCl和病原菌处理30 min内也被迅速诱导[18]，说明AtGT-3b在大豆抗DC3000的侵染反应中起作用。毛果杨(Populustrichocarpa)受到链格孢霉菌(Alternariaalternata)侵染后，除了3个Trihelix家族成员表达量下调，其他成员表达量均上调，且将PtrGT10在秋子梨(Pyrusussuriensis)中抑制表达后，活性氧和MDA的含量均下降，细胞死亡率有所降低[19]。有关Trihelix家族功能的研究主要集中在光反应、对植物生长发育的调控及抵抗各种非生物胁迫上，在抗病反应中的研究鲜见报道。本研究采用生物信息学方法，对白桦Tihelix家族成员进行鉴定比较，并分析白桦Trihelix家族成员组织表达特异性及病原菌胁迫响应情况，为进一步了解Trihelix家族成员的结构与功能提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和处理

(1)供试植物及病原真菌：用于链格孢霉菌侵染的白桦植株为40～50 cm的白桦幼苗，用于立枯丝核菌侵染的植株为无菌土培苗，高度为6～8 cm。供试植株均为组织培养所得无性系。培养条件为28 ℃、光照/黑暗为16 h/8 h，光照强度1 500 Lx。致病菌链格孢霉菌(Alternariaalternata)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)为本实验室保存。

(2)培养基：使用马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose agar，PDA)培养两种病原菌，培养基成分为马铃薯300 g/L+葡萄糖20 g/L+琼脂20 g/L。白桦扩繁培养基：WPM 2.14 g/L+琼脂7 g/L+蔗糖20 g/L+Ca(NO3)20.56 g/L+6 BA 1.5 mg/L+NaOH 1 mL/L；生根培养基：WPM 2.14 g/L+琼脂7 g/L+蔗糖20 g/L+Ca(NO3)20.56 g/L+NAA 0.2 mg/L+NaOH 1mL/L；无菌土培苗的培养：草炭土和蛭石比例为1∶1，将二者混匀后加入蒸馏水至潮湿状态。

(3)病原菌侵染：将链格孢霉菌(Alternariaalternata)菌株接种于PDA斜面上扩大培养，于25 ℃培养箱中培养6～7 d，在长满菌丝的斜面中加入无菌水后震荡，再用双层纱布过滤掉菌丝，收集孢子悬浮液，无菌水冲洗滤渣2～3次，将滤液定容至10 mL。用血球计数板计数，孢子悬浮液稀释浓度至105个/mL。采用喷雾法将孢子悬浮液均匀喷到植株叶片上，将植株置于透明的塑料箱中密闭保湿24 h，然后转移至光照培养箱中，28℃、光照/黑暗16 h/8 h、光照强度1 500 Lx条件下培养，每天观察植株染病情况；将立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)接种于PDA平板上，置于25 ℃培养箱中培养6～7 d，待菌丝长满整个培养皿，用无菌刀片刮取0.05 g菌丝，加入20 mL无菌水配制成菌悬液，采用注射法，将菌悬液注射到白桦幼苗根部。分别在侵染6、12、24和48 h，以及3、5、7 d后，取链格孢霉菌侵染的植株叶片以及立枯丝核菌侵染的整个植株作为样品，液氮速冻后于-80 ℃中保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 白桦Trihelix家族成员的鉴定利用COGE数据库(https://genomevolution.org/coge/)筛选白桦基因组序列中Trihelix基因序列，筛选掉序列中的重复序列，并在NCBI中进行同源比对及保守结构域分析，保留含有Trihelix结构域的序列，确定为白桦Trihelix家族成员。

1.2.2 白桦Trihelix家族生物信息学分析利用Phytozome v12.1数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)查询毛果杨和拟南芥Trihelix家族蛋白序列；利用Clustal X软件进行基因家族氨基酸序列的多序列比对，利用MEGA7.0软件并采用邻接法构建进化树；从COGE数据库中获得白桦每个Trihelix家族成员启动子上游1 500 bp的基因序列，并用Plant CARE(http:// bioinformatics.psb.ugent.bewebtoolsplantcarehtml)预测其顺式作用元件。使用Origin8.5制作折线图。其他分析网站及软件见表1。

表1 生物信息学分析的软件及网址Table 1 Software and website for bioinformatic analysis

1.2.3 RNA提取及反转录使用植物总RNA提取试剂盒(BioTeke, 无锡)提取白桦根、茎、叶部位的总RNA及两种病菌侵染后各时间段样品的总RNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取质量，超微量分光光度计测量RNA浓度。以1 μg的RNA为模板，利用反转录酶(Vazyme, 南京)将其反转录合成为cDNA。

1.2.4 荧光定量PCR以白桦持家基因18S rRNA、肌动蛋白基因Actin和泛素基因Ubiquitin为内参基因，以茎中BpTrihelix1基因为对照，计算根和叶片中各基因的相对表达量；以未感病时叶片中BpTrihelix1基因为对照，计算链格孢霉感染后各基因的相对表达量；以未感病时整株的BpTrihelix1基因为对照，计算立枯丝核菌感染后各基因的相对表达量；使用引物序列见表2。反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 15 s，58 ℃ 45 s，共45个循环。每个处理进行3次生物学重复，以2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

表2 荧光定量所用的基因引物序列Table 2 Primer sequences of the genes used for quantitative real-time PCR

2 结果与分析

2.1 白桦Trihelix家族成员蛋白理化性质分析

经过筛选重复序列、保守结构域鉴定以及同源性比对，最终获得了8个Trihelix家族成员(表3)。根据其在染色体上的位置，将其命名为BpTrihelix1-BpTrihelix8(图1)。在8个家族成员中，长度最长的序列为BpTrihelix5 (8 934 bp)，长度最短的为BpTrihelix8(2 049 bp)；氨基酸的数量在307～591 aa之间(表3)；氨基酸分子量在35 633.96～81 871.27 Da之间；等电点在5.32～8.67之间，且均为疏水性氨基酸；亚细胞定位结果表明，所有家族成员均定位在细胞核中。

表3 白桦Trihelix家族成员基本信息Table 3 Basic information of Trihelix family members in birch

2.2 白桦Trihelix家族蛋白的系统进化分析

系统进化分析显示(图2)，8条白桦Trihelix家族氨基酸序列被分为4个分支，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。其中Ⅲ中包含白桦Trihelix蛋白序列最多，含有3条；Ⅰ和Ⅱ均含有2条白桦Trihelix蛋白序列；Ⅳ中包含1条白桦Trihelix蛋白序列，数量最少。

2.3 白桦Trihelix基因结构分析及蛋白结构分析

基因结构如图3所示，白桦Trihelix家族成员含有2～5个外显子，其中，BpTrihelix1含有的外显子数量最多为5个，BpTrihelix5和BpTrihelix7均含有3个外显子，BpTrihelix2、BpTrihelix3、BpTrihelix4、BpTrihelix6和BpTrihelix8均含有2个外显子。利用DNAMAN软件对白桦Trihelix家族成员的氨基酸序列进行多序列比对(图4)，结果表明Trihelix家族成员都具有螺旋-环-螺旋-环-螺旋这一特殊构象。利用MEME网站对白桦Trihelix家族成员蛋白序列进行Motif搜索，设置搜索数量为10个，结果如图5所示，所有家族成员均含有数量不等的保守基序，且所有家族成员均含有Motif 1基序。不同亚家族间保守基序也有差异，如Motif 10仅存在于第Ⅱ亚家族中，Motif 9仅存在于第Ⅲ亚家族中。

2.4 白桦Trihelix家族启动子区顺式作用元件预测

将白桦Trihelix家族各成员上游1 500 bp的序列确定为启动子序列，利用PLANT Care进行顺式作用元件预测，结果如表4所示。白桦Trihelix家族含有种类较为丰富的顺式作用元件，除了一些真核启动子的必需元件，如CAAT-box、TATA-box外，还有一些与植物胁迫、生长发育、激素响应及光应答相关的元件。其中BpTrihelix2、BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7含有胁迫相关元件的数量和种类较多，推测它们可能在不同的胁迫下起关键作用；BpTrihelix4、BpTrihelix5和BpTrihelix6含有激素响应相关元件种类较多，推测它们能够对不同种类激素有响应；BpTrihelix4含有的光响应元件种类最多，推测BpTrihelix4可能对光响应过程起调控作用。

表4 白桦Trihelix家族启动子区顺式作用元件预测Table 4 Prediction of cis-acting elements of Trihelix family promoters in birch

2.5 白桦Trihelix家族成员组织表达分析

琼脂糖凝胶电泳检测表明，RNA提取无降解(图6)，且OD260/280在1.7～2.0之间，符合实验要求。根据相对定量的结果,用Clustvis制作热图(图7)，结果表明，所有基因在不同组织中均有表达，其中的BpTrihelix3在叶片中表达量最高，随后依次是BpTrihelix4、BpTrihelix7、BpTrihelix1、BpTrihelix5、BpTrihelix8、BpTrihelix6，BpTrihelix2的表达量最低；BpTrihelix3在茎中表达量最高，然后是BpTrihelix7、BpTrihelix1、BpTrihelix4、BpTrihelix5、BpTrihelix8、BpTrihelix2，BpTrihelix6的表达量最低；BpTrihelix3在根中表达量最高，然后是BpTrihelix1、BpTrihelix7、BpTrihelix5、BpTrihelix4、BpTrihelix6、BpTrihelix8，BpTrihelix2的表达量最低。

2.6 链格孢霉菌侵染后Trihelix基因家族的表达

为研究白桦Trihelix基因家族成员对链格孢霉的响应情况，分别对侵染不同时间的白桦植株叶片中各基因的表达量进行分析，结果(图8)显示：BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7的表达量有明显的变化，且三者的表达量均呈先上升后下降的趋势。在感病24 h时，三者的表达量开始上升，BpTrihelix3和BpTrihelix4的表达量均在2 d时达到峰值，此时，相对表达量分别为对照的31.1和38.7倍，BpTrihelix7的表达量在感染5 d时达到峰值，相对表达量为对照的6倍；BpTrihelix1和BpTrihelix5的表达量在2 d时开始有微弱的变化，其余基因的表达量几乎无变化。

2.7 立枯丝核菌侵染后Trihelix基因家族成员的表达

为研究白桦Trihelix基因家族成员对立枯丝核菌的响应情况，分别对侵染不同时间的白桦幼苗整株中各基因的表达量进行分析，结果如图9所示。其中，BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7表达量的变化最为明显，且三者的表达量均是在感病后开始下降，直到12 h开始上升，在24 h达到峰值，相对表达量分别为对照的10.3倍、6.7倍和9.4倍；BpTrihelix1和BpTrihelix5的表达量也有不同变化，二者的表达量也在感病后呈下降趋势，不同的是，BpTrihelix5的表达量在感病6 h时开始升高，在12 h达到峰值；BpTrihelix1的表达量在12 h时才开始上升，在24 h达到峰值；其余基因的表达量无明显变化。

3 讨 论

转录因子能够与基因启动子上的顺式作用元件结合，在细胞核中调控下游靶基因的表达[20]。Trihelix家族是一类转录因子家族，最早在豌豆中被发现[10]，随后，在拟南芥、水稻中陆续鉴定出多个该家族成员[21-22]。本研究在白桦中共鉴定到8个Trihelix家族成员，均定位在细胞核中，符合转录因子的细胞定位特征。Trihelix家族基因发挥作用主要通过与GT元件结合得以实现，GT元件属于顺式作用元件，最初的研究证明该元件与光反应有关。近些年不同功能的GT元件被鉴定出来[23]，如大豆中的SBF-1因子能与Box1、Box2及Box3元件结合，从而参与植物生长发育过程[24]。GT-1-like转录因子——AtGT-3b可以与GT-1元件结合，在拟南芥病原菌胁迫中发挥作用[18]。本研究发现，白桦Trihelix家族各成员均含有典型的三螺旋结构，具备与GT元件结合的结构特征，且其启动子上具有与抗胁迫、生长发育和激素调节有关的顺式作用元件，推测白桦Trihelix家族成员可能参与白桦的生长发育以及各种非生物胁迫和生物胁迫响应等生命过程。

研究表明，Trihelix家族基因在不同组织和器官中均有不同程度的表达。大豆中，GmGT2A在茎中的表达量最高，在种子中表达量则为0[25]；棉花GhGTs基因在棉花的根、茎、叶、花、胚珠及纤维均有表达，但表达程度有所不同[26]。本研究发现，白桦Trihelix家族成员在根、茎、叶中均有不同程度的表达，如BpTrihelix1、BpTrihelix4和BpTrihelix7在叶中的表达量较高，在根中的表达量却极低，而BpTrihelix3在根、茎、叶中的表达量均为最高。基因在不同器官中的差异表达暗示着它们在植物的不同组织、器官中各自发挥着不同的调节作用。Trihelix家族被分为GT-1、GT-2、GTγ、SH4和SIP1五个亚家族，其中，GT-2亚家族被证明包含两个保守结构域[27]，并具有抗非生物胁迫及生物胁迫功能。如拟南芥AtGT2L基因受到低温、高盐和ABA胁迫时，其表达量被迅速诱导[28]；杨树中的PtaGTL1是一种Ca2+-CaM结合蛋白，能通过调节植物气孔密度影响其蒸腾作用，从而提高植物耐旱性[29]；AtGTL1是拟南芥GT-2亚家族成员之一，研究发现它属于AtMPK4信号级联反应中的一部分，能协调水杨酸的代谢，赋予植物对丁香假单胞菌的免疫力[30]。本研究使用两种病原菌侵染白桦幼苗，发现BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7的表达量变化最为明显，氨基酸序列分析发现，这3个基因均具有N端的TN和C端的TC结构域，符合GT-2亚家族的结构特征，说明它们属于GT-2亚家族成员，并可能在白桦的抗病反应过程中具有积极作用。

本研究利用生物信息学方法筛选鉴定出8个白桦Trihelix家族成员，并对该家族成员的结构和功能进行了初步研究，结果发现BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7在白桦各组织中表达量均较高，且都具备GT-2亚家族成员的结构特征，并显著响应两种病原菌的侵染，说明它们在白桦抗病过程中可能发挥重要作用，但具体作用机制还有待于进一步研究。本研究为Trihelix家族基因在白桦抗病过程中的功能研究提供了参考。