不同食品级氮源对发酵肉用乳酸菌生长的影响

郭 瑞 李亚楠 李怡阳 石晶红

河套学院 内蒙古巴彦淖尔 015000

乳酸菌的培养基种类繁多，大致可分为以乳清蛋白为基质的培养基、以脱脂乳为基质的培养基、以MRS为基质的培养基。乳清蛋白培养基中的乳清蛋白易发生热变性，产生沉淀，且活菌数低；脱脂乳培养基虽然经济易得，价格低廉，但是粘度大，菌体不易浓缩分离，MRS培养基价格贵，且应用在食品中味道不佳[1]。

随着我国食品工业的发展，乳酸菌发酵肉制品以其风味独特，营养丰富，易于消化等诸多优点备受食品加工企业和研究人员的关注。而目前直投式乳酸菌培养基的研究主要集中在发酵乳制品方面，针对发酵肉质品直投式乳酸菌培养基的相关研究较少，这严重影响和限制了发酵肉制品研究技术的应用和推广。

试验以河套学院食品微生物实验室分离纯化出的发酵肉用植物乳杆菌为种子菌株,将MRS培养基中的氮源替换为廉价的含有大量含氮物质的食品原料，探索不同食品级氮源对发酵肉用乳酸菌生长的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

黄豆芽、黑豆、平菇、黄豆、青岛啤酒(麦芽浓度10°P,酒精度≥4.0%)(市售)；

豆腐渣、葵花粕、酒糟，河套学院农学系农产品加工实验室提供；

鱼内脏，河套学院农学系畜产品加工实验室提供；

植物乳杆菌，河套学院农学系食品微生物实验室提供；

NaOH、酚酞、硫酸镁分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；

无水乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸锰分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司；

无水葡萄糖、吐温80分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；

牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；

柠檬酸铵分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

电子天平(TD5002A)，天津天马衡基仪器有限公司；

电子分析天平(BSA323S)，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-30KB)，上海申安医疗器械厂；

电热恒温培养箱(SKP-01)，湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司；

智城超净工作台(ZHJH-C1112B)，上海智城分析仪器制造有限公司；

漩涡混合器(XH-D)，海门市麒麟医用仪器厂；

分光光度计723型，上海凤凰光学科仪有限公司；

料理机(JYL-C19V)，九阳股份有限公司。

1.3 菌种的活化

将植物乳杆菌在液体MRS培养基中活化两代，37℃培养16.5h。

1.4 原料的处理

分别称取固体食品原料50g，加入1 000mL蒸馏水于料理机中打碎，熬煮后过滤，取其滤液备用。

1.5 单一食品级氮源对比实验

原料分别熬煮30min和1h，过滤，得到滤液。分别移取70mL滤液加入到去除氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉)的MRS液体培养基中，用蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.2～6.5，接种植物乳杆菌，接种量为1%，37℃培养13h。以MRS培养基作为空白对照。每1h取样测定菌液吸光值和滴定酸度。

1.6 两种食品级氮源混合实验

移取筛选出的食品级氮源滤液35mL加入到去除氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉)的MRS液体培养基中，再分别加入啤酒或酒糟滤液35mL，用蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.2～6.5，接种植物乳杆菌，接种量为1%，37℃培养13h。以MRS培养基作为空白对照。每1h取样测定菌液吸光值和滴定酸度。

1.7 三种食品级氮源混合实验

分别移取筛选出的两种食品级氮源滤液各35mL替代MRS液体培养基中的氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉)，用鱼内脏滤液代替蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.2～6.5，接种植物乳杆菌，接种量为1%，37℃培养13h。以MRS培养基作为空白对照。每1h取样测定菌液吸光值和滴定酸度。

1.8 菌液吸光值的测定

用723型分光光度计测定菌悬液600nm处的OD值，比较其生长情况。

1.9 滴定酸度的测定

滴定酸度的测定采用0.1mol/L NaOH进行滴定，按照GB12456-2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》[2]方法测定。

2 结果与分析

2.1 单一食品级氮源对发酵肉用乳酸菌生长的影响

由图1和图2分析可得，豆腐渣和黑豆作为氮源的培养基中，随着熬煮时间的延长，植物乳杆菌的生长情况反而不佳。这是因为豆腐渣和黑豆中虽然蛋白质含量丰富，但在熬煮过程中水溶性蛋白质发生热变形，其含量随着温度的升高和提取时间的延长而急剧下降[3]，即熬煮时间越长滤液中提取的含氮化合物越少，越不利于植物乳杆菌的生长。但是其菌液的滴定酸度与菌体的生长情况却相反，添加熬煮1h滤液作为氮源的培养基滴定酸度均显著高于熬煮30min滤液作为氮源的培养基的滴定酸度。这是因为本试验所选用的乳酸菌为发酵肉用植物乳杆菌，其代谢过程中可产生大量脂肪酶，降解脂肪产生脂肪酸，导致滴定酸度的升高。随着熬煮时间的延长，豆腐渣和黑豆中的脂肪被提取到滤液中的含量增多，其滴定酸度也明显更高。鱼内脏作为氮源的培养基中菌体生长情况不是最好，而滴定酸度却最高也是这个原因。葵花粕的滤液中也含有大量脂肪，但是其同时含有能抑制脂肪酶活性的绿原酸[4]，所以其滴定酸度并不高。

黄豆芽、鱼内脏、平菇、葵花粕和酒糟随着熬煮时间的延长植物乳杆菌的生长情况也更好。其中加入熬煮1h的氮源的培养基中，平菇和豆芽作为氮源的植物乳杆菌生长情况与MRS液体培养基接近。豆芽是由大豆浸泡后发出的嫩芽，在萌发过程中，部分蛋白质会分解为各种氨基酸，其含量可达到豆子原含量的7倍，并释放出更多的磷、锌、铁、钙、镁等矿物质，维生素类物质的含量也会大大增加[5]。平菇是人工栽培中产量较高的一种食用菌，蛋白质含量高达23.22%，氨基酸含量为3.447%，还含有大量的维生素和磷、钾、钠、铜、锌等矿物质[6，7]。通过长时间熬煮，氨基酸、矿物质和维生素等被提取出来添加到培养基中，既提供了植物乳杆菌生长所需的氮源，矿物质和维生素[8]也促进了植物乳杆菌的生长。

2.2 两种食品级氮源混合对发酵肉用乳酸菌生长的影响

每升啤酒约含有3.5g蛋白质的水解产物一肽和氨基酸[9]；白酒酒糟是以高粱、玉米、豌豆、小麦等谷物为原料经过蒸煮、发酵、蒸馏出酒后产生的固体废弃物，含有丰富的淀粉、蛋白质及大量的氨基酸[10]，据统计每100g白酒酒糟中含有维生素C 37.5mg[11]，可促进植物乳杆菌的生长[8]。所以选用啤酒原液和经熬煮1h所得的白酒酒糟滤液与筛选出的熬煮1h获得的豆芽和平菇的滤液1∶1混合后，替代MRS中的氮源培养植物乳杆菌。

由图3和图4分析可得，啤酒豆芽混合作为氮源的培养基中植物乳杆菌的生长情况最接近MRS但并未超过或者达到MRS的增菌能力，其他三种组合作为氮源的培养基中植物乳杆菌的生长情况并不理想。可能是由于豆芽、平菇、啤酒和酒糟皆为植物性氮源，所提供的氮源种类比较单一，不能完全替代MRS培养基中牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉的作用。

2.3 三种食品级氮源混合对发酵肉用乳酸菌生长的影响

淡水鱼内脏的干物质中蛋白质含量在23%以上，其必需氨基酸除含硫氨基酸含量偏低外，其他必需氨基酸均接近或超过全蛋蛋白[12]，是一种极佳的动物性氮源，将其与植物性氮源按比例混合，替代MRS培养基中的氮源，可以弥补单纯使用植物性氮源的不足。

由图5和图6分析可得，三种食品级氮源混合所配制的培养基中植物乳杆菌的长速度快，均优于MRS对照，且分别于接种后2h内即进入对数生长期，比MRS培养基中植物乳杆菌的对数生长期提前3h，并于9h左右进入对数生长末期。其中酒糟豆芽鱼内脏三种氮源混合结果最佳，啤酒豆芽鱼内脏次之。实验证明，种类多样的食品级氮源在提供氮源的基础上又增加了碳源以及生长因子等的含量，更有助于发酵肉用植物乳杆菌的生长。

3 结论

通过对实验结果分析表明，用食品中的氮源替换原MRS液体培养基中的氮源切实可行，将动物性氮源与植物性氮源混合效果优于单纯使用植物性氮源。其中白酒酒糟豆芽鱼内脏的组合最有利于发酵肉用乳酸菌的生长，且生长性能优于MRS培养基。其工艺条件为分别称取豆芽，鱼内脏和白酒酒糟50g，分别加入1 000mL蒸馏水于料理机中打碎，熬煮1h后过滤，取豆芽和白酒酒糟滤液各35mL替代MRS液体培养基中的氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉)，用鱼内脏滤液代替蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.2～6.5。

酒糟和鱼内脏均为食品加工过程中产生的废弃物，若以其作为直投式发酵肉用乳酸菌培养基的氮源，既可以获得高质量的乳酸菌，又可以减少资源浪费，降低生产成本，有利于发酵肉制品研究技术的应用和推广。