TCAB1蛋白在喉鳞癌组织中的表达及与临床特征之间的关系

鲁 丹 张 燚 胡 安 李 璨 乔培培 薛晓成 陈晓平

上海市浦东新区公利医院耳鼻咽喉头颈外科，上海 200135

喉鳞癌是耳鼻咽喉头颈外科常见的恶性肿瘤之一[1]，喉鳞癌患者早期症状常不明显，发现时多数处于中晚期，术后生活质量不佳[2]。头颈部鳞癌的发生受到多种因素的影响，有研究表明EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染与头颈部鳞癌的发生密切相关[3]。

EBV是普遍存在的人类γ-疱疹科病毒，在肿瘤细胞中能有效地激活细胞周期，使被感染的细胞能够持续增殖，EBV可以表达具有转化特性的各种潜伏期相关蛋白[4]，这些蛋白的过表达促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，阻断病毒裂解复制，确保胞外病毒基因组准确地向子代细胞分化。同时可以通过多种不同的信号通路上调肿瘤细胞系中端粒酶的活性[5]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2011—2018年宁夏医科大学附属总院（n=113）和上海市眼耳鼻喉科医院的耳鼻咽喉科（n=12）收治的125份喉鳞癌组织及癌旁组织标本。标本患者中男122例，女3例，年龄37～82岁。根据世界卫生组织对年龄段的划分[6]，分为青年组、中年组、年轻老年组、老年组。根据病程长短划分为三组，＜1年组，1～2年组，＞2年组。根据美国癌症协会（American joint committee on cancer，AJCC）2017年第8版的喉鳞癌临床分期标准将喉鳞癌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期[7]。根据病理分化程度划分为低分化组、中分化组、高分化组。根据肿瘤的发生部位，可以划分为声门上区、声门区、声门下区、跨声门区。本研究经上海市浦东新区公利医院伦理委员会通过。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：经手术及病理证实为喉鳞癌；有完整的临床资料（包括术前影像学检查、术后随访）；每例喉鳞癌标本均能正常进行EBV检测及免疫组化染色、Western blotting技术检测。排除标准：术前有化疗或放疗史；复发的患者；合并邻近组织的肿瘤；合并其他脏器的肿瘤；收集的喉鳞癌标本无完整癌旁组织对照组。

1.3 方法

将125份喉鳞癌及癌旁组织石蜡样本进行EBV基因检测，同时进行TCAB1蛋白免疫组化检查。结果判断：根据细胞阳性着色程度，着色成功的视为阳性，未成功着色的视为阴性。根据细胞阳性着色数量及占比可分为阴性（-）、弱阳性（+-）、阳性（+）、中等阳性（++）及强阳性（+++）。阳性率=（弱阳性+阳性+中等阳性+强阳性）例数/总例数×100%。

1.4 统计学方法

应用SPSS 22.0统计学软件对研究数据进行统计学分析。计数资料采用χ2检验，生存函数Kaplan-Meier法进行生存率的分析，使用Log-rank检验比较生存风险，终点事件为患者病死，生存时间以月为单位进行统计。采用生存分析及COX回归模型统计学方法，对有效数据进行生存状况分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EBV在喉鳞癌组织中的表达情况

本研究发现分化程度、临床分期、肿瘤部位与EBV感染比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），可认为患者的分化程度、临床分期、肿瘤部位与EBV感染无相关性。见表1。

表1 喉鳞癌组织中EBV感染与患者临床病理特征的关系[n（%）]

2.2 TCAB1蛋白在喉鳞癌组织中的表达情况

2.2.1 TCAB1蛋白在喉鳞癌组织中的表达情况 125例喉鳞癌组织标本中TCAB1蛋白表达阳性98例，阳性率为78.4%。TCAB1基因是位于细胞核内染色体末端的端粒酶上（图1A～D），TCAB1蛋白主要在细胞核内表达，细胞质中也有少量表达（图1E～F），差异有统计学意义（P＜ 0.05），提示TCAB1蛋白较正常组织在喉鳞癌组织中更高表达。见表2。

表2 TCAB1蛋白在喉鳞癌组织及其癌旁组织中的表达

图1 喉鳞癌组织中TCAB1的不同分级表达

2.2.2 喉鳞癌组织中TCAB1蛋白表达与患者临床病理特征的相关性情况 TCAB1蛋白阳性组肿瘤部位与TCAB1蛋白阴性组比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），认为喉鳞癌组织中TCAB1蛋白表达与患者的肿瘤部位、临床分期、病理分化程度无相关性。见表3。

表3 TCAB1蛋白表达与喉鳞癌患者临床病理特征的关系

2.2.3 喉鳞癌组织中TCAB1蛋白的表达与EBV感染的相关性情况 喉鳞癌组织中TCAB1蛋白过表达与EBV感染有相关性，见表4，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

表4 喉鳞癌组织中TCAB1蛋白表达与EBV感染的关系

2.3 喉鳞癌术后患者生存分析

2019年3 月通过电话随访宁夏医科大学总院收集的113份喉鳞癌患者术后生存状态，失访38例，有效数据75例，男73例，女2例。复发/转移2例，病死7例。

2.3.1 喉鳞癌患者的一般临床特征与预后关系的分析 本研究中喉鳞癌患者总生存率为86.7%，1年总生存率为98.7%，3年总生存率为96.0%，5年总生存率为90.7%，8年总生存率为86.6%。累积生存函数图显示随着随访时间逐步递增，喉鳞癌术后患者的生存率逐步下降，累积风险函数图显示随着随访时间逐步递增，喉鳞癌术后患者的病死风险逐步攀升（图2）。可以认为肿瘤部位是喉鳞癌患者术后的预后独立危险因素（P＜ 0.05）。见表5。

表5 肿瘤部位的COX比例风险分析

图2 累计生存函数

2.3.2 TCAB1表达与生存状况分析 75例随访数据中，TCAB1阳性喉鳞癌患者有60例，其中病死9例，阴性喉鳞癌患者15例，其中病死2例。TCAB1阳性喉鳞癌患者中1年生存率为98.3%，3年生存率为91.5%，5年生存率为89.2%，8年生存率为53.0%。TCAB1阴性喉鳞癌患者中1年生存率为100%，3年生存率为92.9%，5年生存率为82.5%。经统计分析可以认为TCAB1蛋白的表达情况与喉鳞癌术后患者的预后差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见图3。

图3 TCAB1蛋白表达情况与喉鳞癌术后患者预后的生存曲线

3 讨论

恶性肿瘤较正常组织最大的不同之处在于其侵袭力强、容易复发转移和增殖能力无限，容易使人发生恶病质。端粒是位于染色体末端控制细胞增殖的基因位点，在分化良好的组织中其活性受到抑制，而在恶性肿瘤中被重新激活。TCAB1蛋白作为端粒酶全酶的一种，在端粒酶活性的维持和激活中起着关键作用[8]。本研究采用免疫组化和Western blotting检测从蛋白质水平分析了TCAB1基因的表达异常是否参与了喉鳞癌的发生发展，并探讨了TCAB1蛋白的表达与EBV感染是否相关。结果表明喉鳞癌组织中TCAB1蛋白的表达与EBV感染有关。本研究还利用生存分析统计学方法分析了喉鳞癌术后患者预后的独立危险因素，发现EBV感染与TCAB1蛋白的表达与喉鳞癌患者预后无明显相关性。

本研究发现喉鳞癌患者绝大多数为男性（122/125，97.6%），女性中较少见。年龄多在中年人到年轻老年人阶段（45～74岁，86.4%），肿瘤发生部位多位于声门区（92/125，73.6%），病程多在一年之内（91/125，72.8%），然而临床分期之间和病理分化程度之间并无显著差别。这与我国多次统计的结果一致[9]。男性患者更易罹患喉鳞癌，具体原因仍不明确。有研究认为喉鳞癌的发生与持续饮酒、高龄以及男性喉部作为男性发育的第二性征、积累的雄性激素较女性明显增多等因素有关[10]。喉鳞癌多位于声门区，早期即可表现声音嘶哑、刺激性咳嗽，患者多以此为首发症状就诊，故一年内发病者较多见。位于声门上区及声门下区喉鳞癌患者由于早期症状多不明显，就诊发现时多为中晚期，术后生活质量较差[11]。

关于EBV感染与喉鳞癌的相关性研究，国内外尚无统一意见。本研究结果与前期研究有一定的异同，研究较一致的是EBV感染与喉鳞癌患者的喉鳞癌组织的分化程度、临床分期、肿瘤部位无显著相关性[12]。Muderris等[13-14]的研究中EBV感染阳性率较本研究明显减少，分析其原因可能与Muderris 等研究中样本量少有关，而Vazquez-Guillen等[14]研究采用的检测方法是水解PCR探针，与本研究方法有出入，且可能与研究人群的民族和地域不同有关。

TCAB1又称WDR79，WRAP53，是真核细胞染色体末端的重复WD结构，维持卡哈尔体形成、端粒的延长及DNA损伤修复，在将端粒运输到卡哈尔体的过程中具有重要作用[15]。但与头颈肿瘤的相关性及具体机制研究较少，Sun等[16]发现TCAB1在头颈恶性肿瘤的临床标本和癌细胞系中显著过表达，随着TCAB1的下调，体外细胞的增殖潜能和侵袭能力也出现了明显降低，异种移植实验也证实，TCAB1基因的沉默会抑制裸鼠肿瘤的形成。Mahmoudi等[17]发现TCAB1的过表达与头颈肿瘤的预后不良相关，TCAB1蛋白的下调可以通过线粒体途径引起大量细胞凋亡，Bax/Bak的活化、线粒体膜电位的丧失和细胞色素C的释放，与正常细胞相比肿瘤细胞对TCAB1的耗竭更为敏感。在喉鳞癌放射治疗方面，Qiu等[18]发现可利用RNA干扰技术降低TCAB1的表达影响端粒长度来提高喉鳞癌细胞系的放射敏感性。本研究采用免疫组化法分析了125份喉鳞癌患者的肿瘤标本，发现TCAB1蛋白在喉鳞癌组织中的表达明显高于癌旁组织。喉鳞癌的发生发展及其预后与喉鳞癌发生的部位、临床分期、病理分化程度都有一定的关系。Tang等[19]回顾性分析了659例喉鳞癌患者的术后生存情况，指出临床T分期、喉鳞癌组织分化程度是喉鳞癌复发和进展的独立危险因素。而本研究发现TCAB1蛋白的表达与喉鳞癌患者的组织分化程度、临床分期、肿瘤部位无明显相关性。因此，TCAB1基因影响喉鳞癌发生的具体作用机制仍需要继续探讨，进一步研究TCAB1在喉鳞癌发生发展以及预后等过程中的作用机制。

本研究采用生存分析方法对随访到的75例患者数据进行分析，发现喉鳞癌术后患者的预后与其临床分期、病理分化程度无明显相关性，同时EBV感染、TCAB1蛋白表达情况与喉鳞癌预后也无明显关系。这与其他研究者结果有差异。可能的原因主要有：①本研究对象为2011—2018年喉鳞癌术后患者，失访患者严重影响了研究结果；②本研究对象为宁夏地区喉鳞癌患者，可能存在地域差异。