青蒿提取物治疗兔球虫病效果评价

2022-08-18王丽坤金振华张国华鹿凌岩郝彩虹刘珈羽田秋丰

现代畜牧兽医 2022年7期

王丽坤，金振华，张国华，张备，鹿凌岩，郝彩虹，刘珈羽，田秋丰

（黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005）

兔球虫病是对兔养殖业危害最严重的寄生虫疾病之一，一年四季均可发生[1]，各年龄段均易感，断奶至4 月龄的幼兔尤为易感[2]。兔球虫病一旦暴发，常危及整个兔养殖场，对养兔业造成巨大的经济损失。兔球虫的生活史包括孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖等3个阶段[3]，其中孢子生殖过程通常在宿主体外进行，裂殖生殖和配子生殖则于宿主细胞内完成，兔经口感染孢子化的球虫卵囊而发病[4]。兔球虫病的防治长期依赖化学类药物和抗生素类药物，进而引发耐药性和药物残留问题[5]。中药因毒副作用小、不易产生耐药性等特点有望成为防治兔球虫病的新选择。

我国古代的中药学著作《神农本草经》中记载，青蒿具有良好的抗菌、杀虫作用[6]。青蒿属菊科植物中的黄花蒿种属，其主要有效成分青蒿素在国际上获得了极大的认可，具有抗球虫、抗菌和免疫调节等作用[7-8]。青蒿提取物对兔球虫卵囊体外孢子化具有较好的抑制作用，且随着药物浓度的增高，卵囊孢子化呈下降趋势，但无法杀灭兔球虫卵囊[9]。有研究表明，日粮中添加青蒿花枝干粉治疗兔球虫病可产生与地克珠利相似的治疗效果，且未出现球虫感染强度反弹，还可显著促进动物体增重，降低饲料的成本[10]。本研究利用超声波提取法提取青蒿有效成分，以商品化妥曲珠利为对照，评价青蒿提取物治疗兔球虫病的治疗效果，以期为兔球虫病的防治提供新方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

1～2 月龄的健康幼兔购自齐齐哈尔种兔场，通过粪便检查筛选未感染兔球虫幼兔30只作为试验动物，在已消毒环境下饲养1 w。

1.1.2 兔球虫卵囊

兔球虫卵囊分离自大庆市龙凤区某兔场，采集已人工感染球虫的兔粪样置于容器，应用饱和盐水漂浮法收取上液置于离心管；6 000 r/min 离心5 min，沉淀物放入含有2.5%重铬酸钾溶液的平皿，25 ℃温箱中孵育72 h，孢子化的卵囊保存于4 ℃冰箱。

1.1.3 试验试剂

青蒿购自黑龙江省康复药材有限责任公司。妥曲珠利混悬液（批号：KPOAL 4L）为拜耳（四川）动物保健有限公司生产。其他试剂均为分析纯。

1.1.4 试验仪器

分析天平（上海梅特勒-托利多有限公司）、恒温超声提取机（北京弘祥隆生物技术开发有限公司）、低速离心机（上海安亭科学仪器厂）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、生物显微镜（上海尼康仪器有限公司）；载玻片、盖玻片等。

1.2 试验方法

1.2.1 青蒿有效成分的提取

称取一定量青蒿粉末，按照料液比1∶50 g/mL 加入无水乙醇，将料液放入恒温超声提取机。设置超声波强度120 W、温度50 ℃、超声5 s、间歇5 s、超声时间30 min。5 000 r/min 离心10 min，0.45 μm 滤膜过滤，药液采用旋转蒸发仪进行浓缩后保存。

1.2.2 试验设计

将幼兔随机分为6组，每组5只，各组均在同一条件下分笼饲养。设置空白对照组（不感染不用药）、感染不用药对照组；青蒿提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组，每只幼兔分别按照每日每kg体重喂服5、10、15 g青蒿粉末提取后的浓缩物；妥曲珠利组每只幼兔按照每日每kg体重喂服托曲珠利0.4 mL。

1.2.3 球虫卵囊人工感染

各感染组幼兔均人工感染孢子化兔球虫卵囊5×104个/只，各用药组均于感染当日开始用药，感染后第15 d扑杀剖检。

1.2.4 球虫卵囊计数

分别在人工感染球虫卵囊第0、5、10、15 d收集各组试验兔粪便，取2 g 新鲜粪便置于干净的100 mL 烧杯内，加入8 mL饱和食盐水，玻璃棒捣碎混匀；再加入50 mL饱和食盐水混匀，60目筛网过滤，吸取滤液充满2个计数室；显微镜载物台上静置3～5 min，在10倍物镜下镜检计数，分别查完2 个计数室100 个方格内的卵囊数量n1和n2，计算每克粪便中卵囊数量（OPG值）。

式中：2表示2个计数室；0.15表示计数室内每个方格的体积；60表示粪便过滤筛的目数；2表示粪便重量2 g。

卵囊比数为0～1% 时，卵囊值为0；卵囊比数为2%～25%时，卵囊值为5；卵囊比数为26%～50%时，卵囊值为10；51%～75% 时，卵囊值为20；卵囊比数为76%～100%时，卵囊值为40。

1.2.5 相对增重率与存活率

所有健康幼兔在试验前称重记录，扑杀前称重记录。试验期间，记录各组幼兔死亡情况，对死亡的幼兔及时剖检，确定死亡原因。

1.2.6 肠道病变计分

评分标准：0分：肠道中无眼观异常；1分：小肠充血，黏膜稍增厚、呈淡黄色；2分：小肠充血，黏膜肥厚、充血，黏膜面有少量白色小结节，黏液增多，呈桃红色；3分：小肠高度充血，黏膜肥厚，黏膜弥散大量小白结节，肠腔内黏液黏稠，呈黄红色；4分：空肠、回肠肿胀，黏膜呈脑回状，肠腔内充满橙黄色黏液块或麸皮状物，黏膜上密布小结节或结节斑，部分黏膜脱落。

1.2.7 抗球虫指数（ACI）

按照美国默克公司方法，ACI＜120表示药物对球虫无效；120＜ACI＜160 表示低效药物；160＜ACI＜180 表示中等效力的抗球虫药物；ACI＞180表示高效抗球虫药。

1.3 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 19.0 统计学软件进行整理分析，采用X2检验比较。P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 各组不同时间球虫OPG值变化情况（见表1）

由表1可知，试验第5、10、15 d，各感染组OPG值均显著高于空白的对照组（P＜0.05），表明感染成功。试验第5、10、15 d，各用药组幼兔粪便中兔球虫卵囊数均显著低于感染不用药对照组（P＜0.05），表明各用药组的药物均具有一定的抗球虫作用。

表1 各组不同时间球虫OPG值变化情况Tab.1 Changes of OPG value of coccidia at different time in each group单位：×104

各青蒿提取物组幼兔粪便中兔球虫卵囊数随着药物用量的增加，幼兔粪便中兔球虫卵囊数明显降低；经过数据分析，试验第15 d 时，青蒿提取物高剂量组与妥曲珠利组在幼兔粪便中的兔球虫卵囊数差异不显著（P＞0.05），但显著低于其他用药组（P＜0.05）；结果表明，青蒿提取物中剂量组和低剂量组的抗球虫效果较差。

2.2 各组治疗效果总体评价（见表2）

由表2可知，各用药组用药后，通过卵囊值、增重情况、存活情况和肠道病变情况综合评价药物对兔球虫病的治疗效果。结果显示，青蒿提取物高剂量组和妥曲珠利组的ACI 均大于180，青蒿提取物中剂量组和青蒿提取物低剂量组的ACI 分别为178 和149；表明高剂量青蒿提取物和妥曲珠利为高效抗球虫药物，中剂量和低剂量的青蒿提取物分别为中等效力和低等效力的抗球虫药。

表2 各组治疗效果总体评价Tab.2 Overall evaluation of treatment effect in each group

3 讨论

兔球虫病主要危害兔的肝脏和盲肠。兔球虫的虫体寄生于肝脏，造成部分肝细胞变性和坏死，影响肝脏的消化吸收和解毒功能；虫体寄生于肠内，则破坏肠黏膜上皮细胞，使黏膜上皮细胞大量变性坏死、崩解，成为有毒物质，使机体发生自体中毒，进而导致死亡[12]。青蒿性苦、寒，入肝、胆经，苦寒不伤胃，能够宣化胃肠湿热，而上述功效主要归功于青蒿的主要成分青蒿素，可针对肝脏、肠道球虫发挥抑制作用。此外，青蒿素还可以缓解机体炎性反应，具有对机体进行免疫调节的功效[13]，从而对兔球虫病起到标本兼治的目的。因此，青蒿提取物可作为化学类抗球虫药物的替代药物，应用于兔球虫病治疗。

与妥曲珠利等化学类药物相比，青蒿提取物能够更为安全、经济、有效地防治兔球虫病。2015 年的《中国药典》中记载，青蒿具有清虚热、除骨蒸、解暑热、截疟、退黄的功效。青蒿应用于兔球虫治疗可以解决化学药物造成的耐药性以及药物残留的问题，缓解环境污染，提高生物安全。本研究中，高剂量使用青蒿提取物可产生与妥曲珠利相近的治疗效果；且青蒿为草本类植物，属菊科[14]，种类繁多，分布广泛，一般产量较高、成本低，易购买或采集。因此，研究开发青蒿有效成分提取方法及其提取物功效，对青蒿素人工合成技术的改进或研发与青蒿素具有协同作用的某些药物的复方制剂，在球虫病的防治方面具有良好的应用前景[15]。

本研究采用超声波提取方法提取青蒿的有效成分，不仅克服了传统的煎煮法有效成分提取不充分、提取时间长和高温易破坏青蒿有效成分等弊端，而且该方法对仪器设备要求不高，适用于基层养殖场。本研究提供了一种方便、安全、环保、高效治疗兔球虫病的新方法，根据中兽医辩证理论，进一步研发质优价廉、高效低毒、工艺简单、使用方便的中药组方制剂，为兔球虫病的防治及养兔业的健康发展提供参考。