氟通过ROS 对HepG2 细胞氧化损伤的影响

2022-08-18李创业魏筱萱王雨露田二杰周变华

现代畜牧兽医 2022年7期

陈瑜，李创业，魏筱萱，王雨露，田二杰，周变华

（河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023）

氟化物是一种广泛存在于自然界中的环境污染物，过量的氟暴露可导致全身多器官组织损伤[1-3]。氟中毒可引起机体细胞内DNA损伤和线粒体功能障碍[4]，在众多的氟中毒机制中，氧化应激机制受到越来越多的关注。细胞受到外界刺激引起氧化应激时，细胞内会产生大量的活性氧（ROS）[5]；为阻止氧化损伤进一步加剧，细胞会采取提升胞内抗氧化酶活性的方式激活一系列的防御措施，对抗过氧化损伤。ROS 主要由线粒体产生[6]，线粒体不仅能够通过产生ATP 为细胞供能，还可参与细胞衰老和死亡的调控。线粒体内膜上存在大量酶，负担细胞内更多的生化反应；ROS 与胞内脂质、蛋白质相互作用，可促进细胞膜流动性的降低和膜结构的破坏[7]，影响线粒体功能。

受环境污染影响，动物尤其是老年动物肝癌的发病率呈升高趋势[8-10]。HepG2 细胞是一种经典的细胞株，广泛应用于肝细胞损伤作用机制的研究[11-12]。由于动物种属存在差异，加之目前尚无稳定的动物肝细胞株，故本文采用HepG2 细胞，研究氟致HepG2 细胞氧化损伤的分子机制，为动物氟中毒的作用机制的阐述提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验细胞

人肝癌细胞HepG2购自中国科学院细胞库。

1.1.2 主要试剂

NaF（纯度≥98.0%，西陇化工股份有限公司）；11995 DMEM 高糖培养基、P1400 青链霉素混合液（100×）、T1300 胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）；80230-6412胎牛血清（浙江天航生物科技股份有限公司）；S0033S ROS、C2006 MMP 线粒体膜电位检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；A006-2-1 还原型谷胱甘肽（GSH）、A005-1-1 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、A020-2-2 乳酸脱氢酶（LDH）和H545-1-1 谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3 主要仪器

Infinite M Nano酶标仪（上海帝肯贸易有限公司）、311直热型CO2培养箱（赛默飞世尔科技公司）、CKX41倒置显微镜（奥林巴斯株式会社）、Axio Observer.A1 倒置荧光显微镜（上海蔡司光学仪器国际贸易有限公司）、BD Accuri C6流式细胞仪（BD生物公司）、DDW-HW138超低温冰箱（中科美菱低温科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞模型的建立

根据氟暴露HepG2 细胞48 h 的半抑制浓度（IC50值）3.76 mmol/L，选择0、1.88、2.51 和3.76 mmol/L 等4 个氟暴露浓度作为试验分组。待细胞贴壁后，更换含氟离子（F-）浓度为0、1.88、2.51和3.76 mmol/L的完全培养基继续培养48 h，收获细胞，分别命名为对照组、1.88 mmol/L F-组、2.51 mmol/L F-组和3.76 mmol/L F-组。

1.2.2 HepG2细胞形态观察

在6 孔板中培养HepG2 细胞。培养结束后，采用PBS洗涤细胞2 次，加入完全培养基，倒置，显微镜下观察HepG2细胞形态并拍照。

1.2.3 HepG2细胞ROS测定

在6 孔板中培养HepG2 细胞，培养结束后，离心收集细胞。每孔中加入1 mL 含有10 μmol/L DCFH-DA 荧光探针的无血清培养基，37 °C 孵育细胞20 min。采用无血清培养基洗涤细胞3次，流式细胞仪上检测。

1.2.4 HepG2细胞氧化指标的测定

在T-25 瓶中培养HepG2 细胞。培养结束后，收集细胞上清，按照南京建成生物工程研究所检测试剂盒说明书流程，测定HepG2细胞上清的LDH活性。

收集HepG2细胞沉淀，超声破碎细胞，使用BCA法测定HepG2细胞的蛋白浓度，按照南京建成生物工程研究所检测试剂盒说明书流程分别测定HepG2细胞的GSH-Px、GSH和GPX4的活性。

1.2.5 HepG2细胞MMP水平的测定

在6孔板中培养HepG2细胞。培养结束后，每孔加入预先配好的JC-1 染色工作液1 mL，37 °C 孵育细胞25 min。每孔加入JC-1 缓冲液1 mL，洗涤细胞2 次，再加入1 mL完全培养液，荧光显微镜下观察拍照。

1.3 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），Dunnett检验分析对照组与氟处理组组间的差异性。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 氟对HepG2细胞形态的影响（见图1）

由图1 可知，对照组HepG2 细胞形态大小正常较圆润，生长良好，细胞边缘清晰，聚集成片生长；1.88 mmol/L F-组HepG2 细胞细胞间隙增大，细胞融合率降低；2.51 mmol/L F-组HepG2 细胞数量进一步减少，部分细胞边缘不整齐；3.76 mmol/L F-组HepG2细胞数量急剧减少，细胞无法成片生长，细胞边缘模糊。

2.2 氟对HepG2细胞ROS水平的影响（见图2）

由图2 可知，与对照组相比，1.88 mmol/L F-组、2.51 mmol/L F-组和3.76 mmol/L F-组的ROS 水平分别提高了71.75%、209.80% 和411.69%；其中1.88 mmol/L F-组显著提高（P＜0.05），2.51 mmol/L F-组和3.76 mmol/L F-组均极显著提高（P＜0.01）。

图2 氟对HepG2细胞ROS水平的影响Fig.2 Effect of fluoride on ROS levels in HepG2 cells

2.3 氟对HepG2细胞氧化指标的影响（见图3）

图3 氟对HepG2细胞氧化指标的影响Fig.3 Effect of fluoride on oxidation indexes of HepG2 cells

由图3（a）可知，与对照组相比，1.88 mmol/L F-组、2.51 mmol/L F-组和3.76 mmol/L F-组的LDH 活性分别极显著升高了18.38%、39.07%和54.27%（P＜0.01）。

由图3（b）可知，与对照组相比，1.88 mmol/L F-组、2.51 mmol/L F-组和3.76 mmol/L F-组的GSH-Px活性分别极显著降低了15.52%、27.30%和42.59%（P＜0.01）。

由图3（c）可知，与对照组相比，1.88 mmol/L F-组、2.51 mmol/L F-组和3.76 mmol/L F-组的GSH 活性分别极显著降低了16.73%、40.28%和52.60%（P＜0.01）。

由图3（d）可知，与对照组相比，1.88 mmol/L F-组、2.51 mmol/L F-组和3.76 mmol/L F-组的GPX4活性分别极显著降低了36.29%、69.42%和81.30%（P＜0.01）。

2.4 氟对HepG2细胞MMP水平的影响（见图4）

JC-1探针聚集在正常线粒体基质中形成聚合物，显示为红色荧光；当细胞内MMP 下降时，JC-1 探针只能以单体的形式存在于胞质中，显示为绿色荧光。

由图4 可知，与对照组相比，1.88 mmol/L F-组、2.51 mmol/L F-组和3.76 mmol/L F-组绿色荧光∶红色荧光的值分别极显著增加了323.72%、595.71% 和800.15%（P＜0.01），表明各试验组MMP 水平均极显著低于对照组（P＜0.01）。

图4 氟对HepG2细胞MMP水平的影响Fig.4 Effect of fluoride on MMP levels in HepG2 cells

3 讨论

氟在机体内能够与钙、镁等多种离子结合，参与机体的生化反应，维持动物机体正常运转[13]；同时氟还具有破坏原生质的作用，是一种原生质毒物[14]。本研究发现，氟作用下HepG2细胞的密度降低，数目减少，边缘模糊。

细胞内产生大量的信号分子ROS，低水平的ROS主要负责细胞存活的信号调节。癌细胞增殖需要一定水平的ROS，但过量的ROS可导致癌细胞的细胞毒性[15]。GSH具有清除氧自由基的功能；GSH-Px通过催化GSH还原细胞氧化产生的脂质过氧化物，减轻细胞的脂质过氧化程度。GPX4 是谷胱甘肽抗氧化系统的核心调控酶，具有清除细胞内脂质过氧化物的毒性，维持膜脂质的稳态的作用[16]。由于GPX4使用GSH作为催化底物，故GSH含量降低将直接影响GPX4的催化作用[17]。

本研究发现，氟降低了HepG2 细胞内GSH-Px 活性，GSH和GPX4含量也有所降低，提示氟能够干扰HepG2细胞氧代谢过程，刺激细胞产生过量的氧自由基ROS，细胞内的过氧化损伤超过了细胞的抗氧化能力；氟能够抑制HepG2细胞抗氧化酶的活性，导致细胞的氧化损伤。

线粒体作为ROS 产生的主要细胞器，也是ROS 攻击的主要靶点之一，ROS引起的脂质过氧化会导致膜性成分的氧化降解[18]。正常的MMP 是ATP 生成的条件，本试验发现，当细胞的MMP 较低时，其生成ATP 的能力下降，影响了线粒体对细胞的供能[19]。有研究发现，氟作用下HepG2细胞上清液中LDH活性明显增高，表明细胞膜的完整性被破坏[20]。本试验中，在显微镜下也观察到了氟作用下HepG2细胞边缘模糊，提示氟造成细胞膜性结构损伤。