遗传性耳聋相关基因变异的检测方法概述

2022-08-18徐玉鹏郑风劲

中华耳科学杂志 2022年4期

徐玉鹏郑风劲

四川大学华西基础医学与法医学院（成都 610041）

耳聋是导致言语障碍的常见原因，也是影响人口素质的重要疾病，明确耳聋病因、预防耳聋发生是医学问题，也是社会需要。病理学研究证实，耳聋的发生与听觉通路的形态和结构有关，亦可能与内耳等部位的微环境变化有关[1]，导致这些病理学改变的遗传因素和环境因素是目前研究的重点[2]，阻断遗传性耳聋的传递是预防耳聋的有效措施。分子诊断是遗传性诊断疾病的金标准，从精准医学模式的要求来说，耳聋基因诊断是预防和治疗耳聋的第一步。大部分遗传性耳聋被认为是单基因遗传病，家系内传递遵循孟德尔遗传定律，因此开展遗传性耳聋的基因变异检测具有可行性和便利性。遗传性耳聋表现明显的遗传异质性，进行聋病相关基因遗传变异检测存在一定的技术难度[3]。

遗传性耳聋进行相关基因遗传变异检测的最终目的是找到能够完全解释耳聋表型的基因变异，基因变异的种类主要根据美国医学遗传学会（ACMG）、分子病理学家协会和美国病理学家学会（CAP）共同提出的遗传变异解读指南进行分类。最初开展的遗传性耳聋相关基因变异检测集中在常见基因如GJB2、SLC26A4和线粒体基因的热点突变[4]，而新一代测序（Next generation sequencing，NGS）技术正广泛用于遗传性耳聋的分子诊断[5]，越来越成为耳聋基因变异检测的主要手段[6]。对特定的遗传性耳聋患者，制定适宜而有效的基因变异检测方案是一个科学问题，本文从方法学的角度对遗传性耳聋的基因变异诊断策略进行综述。

1 Sanger测序

Sanger测序利用双脱氧链终止原理对DNA片段进行序列测定，是基因检测的标准方法。对多数遗传性耳聋来说，Sanger测序是适宜而精确的基因检测方法。Sanger测序因为通量较低，无法满足大规模测序的需要，目前主要用于对通过其他方法完成基因突变检测的耳聋个体和家系成员的序列复核。

2 基因芯片等热点突变筛查技术

目前用于遗传性耳聋基因突变筛查的方法主要是微阵列基因芯片法和飞行时间质谱法，微阵列基因芯片技术的基本原理是分子杂交测序。由于耳聋基因突变有种族、地域特异性，所以耳聋基因突变筛查芯片可根据目标人群的耳聋分子流行病学特征进行设计。博奥生物工程有限公司和解放军总医院共同研发的晶芯®九项遗传性耳聋基因检测试剂盒是国内最早获准临床使用的耳聋基因芯片，可检测GJB2基因的c.35delG、c.235delC、c.299-300delAT、c.176-191del16bp，SLC26A4基因的c.IVS7-2A＞G、c.2168A＞G，mtDNA12SrRNA基因的m.1555A＞G、m.1494C＞T和GJB3基因的c.538C＞T共4个基因9个突变位点[7,8]。目前临床使用的还有博奥十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒[9]和冯永教授团队设计的Goldengate基因芯片[10]，Goldengate基因芯片涵盖了中国人群已知的46个耳聋基因共240个突变位点，具有通量高、覆盖面广、针对性强的优点，显著提高了耳聋基因变异检测的阳性率。

飞行时间质谱法又称基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，其原理是通过PCR扩增一段包含单核苷酸多态性（SNP）位点的DNA片段，加入延伸引物，通过ddNTP与SNP位点的等位基因对应后用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异来鉴定该位点的碱基。如华大基因公司的耳聋飞行时间质谱技术能检测4个常见耳聋基因20个突变位点[11]。

耳聋基因突变筛查技术具有成本低、操作快、针对性强的优点，目前已普遍用于临床诊断和大规模流行病学研究，但该方法仅适用于已知耳聋基因的已知突变，而大部分遗传性耳聋患者特别是难以通过表型确定致聋基因的患者并不能通过这些技术明确分子病因。

3 耳聋基因靶向捕获测序（Panel测序）

通过突变筛查不能明确分子病因的遗传性耳聋，需要制定耳聋基因Panel测序方案[12]。基因Panel测序是通过将样本DNA与预先定制的多个候选基因探针进行溶液/芯片杂交，完成目标区域的DNA富集后采用高通量测序技术进行序列测定。基因Panel可同时对目标基因编码区和非编码区进行测序，获取相对全面的基因序列信息。基因Panel可根据临床需求和目标基因数量进行设计[13,14]：大基因Panel利用生物素标记探针的靶向富集原理，能获得超过50个基因的基因图谱，但费用相对较高；小基因Panel采用高度特异寡核苷酸进行目标区域扩增并纯化来分析单个碱基的变异，具有诊断用时短、经济便捷的优点[15]。

遗传性耳聋的致病基因庞杂、异质性明显等特点决定了耳聋基因Panel需要制定覆盖面广又有针对性的检测方案，因此在设计耳聋基因Panel时需根据耳聋表型确定与此有强烈相关的候选基因，还需要借助临床辅助检查排除不可能致病的基因。对于临床表型无明显特异性的非综合征型遗传性耳聋，多采用包含所有已知非综合征型耳聋相关基因的Panel方案进行变异检测，甚至将与动物耳聋相关但未在人类发现的、理论推测可能与耳聋相关的基因均纳入检测范围[16]。针对非综合征型耳聋的包含131、146、180或246等基因数的大基因Panel，以及针对综合征型耳聋如Waardenburg综合征、Usher综合征和Perrault综合征等小基因Panel[17]均已经得到了成功应用。

耳聋基因Panel检测具有快速准确的特点，能够实现部分遗传性耳聋的基因变异检测，但该技术无法检测DNA的大片段缺失、插入变异和DNA拷贝数目变异（Copy number variation，CNV）以及未知聋病基因的突变。

4 全外显子组测序（Whole exome sequencing，WES）

人类不同种群间的基因差异不超过1%，且主要表现为外显子差异。人类基因组序列包含的外显子约有18万左右，只占全部基因组的1%-2%，但蛋白编码区约85%的致病突变均与此有关[18]。基于此，如果在完成常见聋病基因突变筛查仍不能明确分子病因，有必要对遗传性耳聋患者进行WES检测。WES最重要的技术环节是外显子区域捕获、测序和候选基因筛查，能够同时对多个基因或基因区域进行分析。目前WES主要使用NimbleGen和In-Solution两种外显子序列捕获技术，NimbleGen技术是将基因组DNA雾化后随机打断成500bp左右的片段，通过与定制的外显子序列捕获芯片杂交连接进行PCR扩增，而In-Solution技术是在基因组DNA被打断后与RNA诱饵形成RNADNA杂合体，后期对目标DNA进行常规PCR扩增。相比较而言NimbleGen方法能可靠地定向捕获基因组区域，但基因组DNA的需求量比较多，适用于小型研究；In-Solution方法特异性和重现率高、对基因组大片段序列的均一性好、可精确地检测SNP，更多应用于大规模基因序列检测[18]。

WES的检测结果基本上包含了全部外显子组的所有突变，并具备检测CNV的能力。因此，WES在遗传性耳聋基因变异检测的应用有利于发现新的耳聋基因和突变基因型[19]，这对完善人类耳聋基因组数据库和基因组变异数据库有很大的好处[20,21]。对于用前述基本方法难以完成分子诊断的遗传性耳聋而言，WES是目前最有价值的变异检测技术。当然WES也存在一些技术局限，本身的测序误差和对外显子的捕获不全在一定程度上影响其诊断准确率。

5 全基因组测序（whole genome sequencing,WGS）

全基因组测序是对全部基因组进行序列测定的方法，涵盖了基因组所有的遗传信息。其主要流程包括打断基因组DNA、回收0.2-5Kb长度的DNA片段、制备DNA簇，利用Solexa或SOLiD方法测定插入片段的序列并组装测序完成的序列，最后通过生物信息学分析个体基因组的结构差异。WGS的准确率与测序深度及覆盖度[22,23]相关，测序深度和覆盖度存在正相关联系，提高测序深度是减少测序错误率和假阳性结果的重要措施。

单从检测基因突变和结构变异来讲，WGS约95%的基因组覆盖率无疑是遗传性耳聋最有效的基因变异检测方法，但考虑到WGS存在测序工作量大、时间长、费用高等实际问题，更多情况下仍然将WGS作为遗传性耳聋WES检测之后的补充诊断方法。与WGS相比，WES的经济和时间成本较低，用WGS的1%测序范围就可以实现WGS约98%的诊断阳性率[24]，WGS的技术优势是除了能检测外显子突变，还可以发现内含子和调控区域的变异。到目前为止，关于内含子和调控区域与聋病的关系尚不明确，所以WGS在遗传性耳聋诊断中的应用范围仍然有限。

6 全基因组扫描

全基因组扫描是从病例和家系表型入手,用数十乃至数万个遗传标志物标记全部染色体以对家系全体成员进行连锁分析、连锁不平衡分析和传递不平衡检验，其目的是发现致病基因在染色体上与哪一个遗传标志最接近。常用的连锁分析方法有两种，分别为参数连锁分析和非参数连锁分析，多数遗传性耳聋的单基因遗传特性决定了其多采用参数连锁分析方法[25]。由于连锁区域内基因数量大，缩小连锁区域，精准寻找候选基因是连锁分析的主要任务。在初步定位可能致聋基因在染色体的位置后，利用覆盖密度高的遗传标志进一步将致聋基因确定在较小的区域，最后结合基因测序技术进行基因变异检测。

近二十多年来，连锁分析结合定位克隆技术被证明是少见和未知基因导致的遗传性耳聋家系分子生物学研究的精确方法之一[26]，对通过已知常见基因突变检测不能明确分子病因的耳聋家系，可选用全基因组扫描方法进行致病基因的定位研究[27,28]。对于通过WES和WGS不能明确致病基因的耳聋家系，全基因组扫描技术定位目标基因所在区域后结合候选基因变异检测是基本的诊断模式。

7 其他基因检测方法

研究显示遗传性耳聋的发生除了单核苷酸变异，还可能存在基因组的重排变异，如CNV[29]。目前检测CNV最常见的方法是多重连接探针扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA）。MLPA利用探针和DNA靶序列进行杂交连接，然后用荧光毛细管电泳分离PCR扩增产物，最后对DNA序列进行定性和半定量分析。通过常见耳聋基因变异检测方法仍不能明确分子病因的遗传性耳聋，可以尝试用高效而特异的MLPA技术进行CNV鉴别诊断。

8 展望

随着测序技术和生物信息学算法的创新发展，耳聋的遗传学诊断有了更多的方法选择，但有效而经济仍然是制定耳聋基因诊断技术路线图的基本原则。遗传性耳聋的基因变异检测首要的是重视聋病本身的表型特征，通过比较分析不同基因变异检测方法的技术优势和局限性（各种耳聋基因变异检测方法的应用比较见表1），选择最有指向性的聋病基因诊断方案。遗传性耳聋的基因变异检测要从常见聋病基因、高频突变入手，通过基因芯片等筛查技术完成一定比例患者的基因突变诊断。耳聋基因Panel检测和WES是目前遗传性耳聋主要的分子诊断手段，而对于采用WES和WGS技术尚不能明确致病基因的耳聋大家系，全基因组扫描连锁分析结合WES的方法是新致聋基因鉴定的有效方法。未来，在遗传性耳聋的基因诊断领域，应该着眼于实现三个方面的技术突破：一是定位耳聋基因，通过基础和临床技术开发实现致聋基因的精准定位；二是改进基因测序技术，减小在海量遗传信息中基因测序的误差；三是降低检测成本，高成本是目前制约聋病基因变异检测开展的主要瓶颈。相信科学技术的进步必然会推动耳聋基因诊断体系的新发展，结合生殖医学和听觉医学新成果的推广，聋病的三级预防必将进入新的时代。