不同贮藏温度下伽师瓜硬度变化的转录组分析

张 琴，唐凤仙，宋 文，周发科，宁 明，单春会*

（1 石河子大学食品学院 新疆石河子 832000 2 石河子大学 新疆特色果蔬贮藏加工教育部工程研究中心 新疆石河子 832000）

伽师瓜属葫芦科（Cutrbitaceae） 黄瓜属（Cucumis L.），因产地在新疆伽师县而得名，居全疆甜瓜之首，被称为“天下第一瓜”。软化是跃变型果实成熟期间发生的主要变化之一，甜瓜作为一种典型的呼吸跃变型果实，在采后贮藏过程中，易迅速软化，从而增加了对机械损伤和病原菌感染的敏感性，缩短了采后贮藏寿命，造成巨大的经济损失[1]。开展伽师瓜果实软化过程的研究，对延长其采后寿命和促进甜瓜产业的发展具有重要意义。

果实的软化与细胞壁成分（如果胶物质、半纤维素和纤维素）的分解密切相关[2-3]。细胞壁的降解过程涉及多种酶，包括果胶酯酶（PE）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、β-葡萄糖苷酶（β-Glu）、内切葡聚糖酶（EGase）、β-木糖苷酶（β-Xyl）[4-5]。PE 主要催化高甲基酯化果胶的去酯化反应，使细胞壁易于被PG 进一步水解[6]；PG 催化聚半乳糖醛酸主链的半乳糖醛酸键的水解[7]，两者协同作用使果实软化。β-Glu 能够水解结合于碳水化合物或糖苷分子非还原性末端的β-D-葡萄糖键，基于底物糖苷配基的活性，β-Glu 在植物中的生理功能包括细胞壁分解代谢[8]、防御病原体[9]和木质化[10]。β-GAL 可作用于鼠李半乳聚糖残基，水解β-1，4-半乳糖键，催化果实软化[11]。已有报道PG、PE、EGase、β-Glu 和β-Gal 在不同贮藏时期，以不同的方式参与甜瓜果实的软化进程[12]。在常温贮藏条件下，1-MCP 通过抑制细胞壁酶（PE、PG、EGase 和β-GAL）活性，来延缓哈密瓜的软化[1]。

温度控制是维持果实采后品质、延长保存期的有效策略，低温能够降低果实代谢率，同时抑制大量参与果实后熟过程酶的活性及相关基因的表达，从而有效延缓采后果实的软化[13-14]。研究不同贮藏温度下伽师瓜果实软化相关酶活性变化，以及相关基因的转录表达，对于了解采后贮藏过程中伽师瓜硬度的变化，以及挖掘软化关键基因具有非常重要的意义。

本试验以伽师瓜为研究对象，对不同温度（0.5，3，21 ℃）贮藏0，12，24 d 的伽师瓜果实进行转录组分析，旨在研究贮藏温度对采后伽师瓜硬度，特别是相关基因表达的影响，以期为伽师瓜的软化调控及贮藏保鲜提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从新疆石河子121 团农场采摘成熟度为八成熟（可溶性固形物含量12%左右）、大小均匀、无病虫害和机械损伤的伽师瓜。采摘后，将每个哈密瓜置于独立塑料网中，然后放入标准纸箱（50 cm×40 cm×18 cm，每箱3～4 个），运往石河子大学食品学院，贮藏温度分别为21，3 ℃和0.5 ℃，相对湿度85%～95%。

酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，上海优选生物科技有限公司；RNA 试剂盒（Trizol），生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TA.XT plus 质构仪，英国Stable Micro Systems 公司；Multifuge X1R 高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技（中国） 有限公司；1X71 多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；LightCycler480 II 型荧光定量PCR 仪，瑞士Rotkreuz 公司。

1.3 方法

1.3.1 样品收集 预冷24 h 后设置为对照组0 d，对3 个温度贮藏下的伽师瓜分别于0，12，24 d取样，每组取样包含6 个瓜，设置3 次重复。取样时，去除2 mm 果皮，并从表面获取4～5 g 哈密瓜组织，样品置于液氮速冻并转移至-80 ℃冰箱中保存，备用。

1.3.2 硬度的测定 根据Ning 等[15]的方法测定伽师瓜果实硬度。将伽师瓜切成厚度为1.5 cm 的薄片，利用质构仪在穿刺模式下测定其硬度，每个瓜设置5 个重复，取平均值。

1.3.3 酶活的测定 果胶酯酶（PE）和β-葡萄糖苷酶（β-Glu）活力均采用ELISA 试剂盒进行测定。

1.3.4 转录组测序及数据分析

1.3.4.1 测序 使用TRIzol RNA 提取试剂盒提取伽师瓜总RNA，cDNA 文库的构建及转录组测序由深圳华大基因研究院完成。

1.3.4.2 基因表达分析 利用RSEM[16]工具进行基因表达定量，表达定量的结果以FPKM 为单位，具体计算公式如下：

式中，C——比对到某基因的fragments 数；N——比对到参考基因的总fragments 数；L——基因编码区的碱基数。

1.3.4.3 差异表达基因的筛选 通过控制错误发现率（FDR）来决定P-value 的阈值，该基因的表达水平（FPKM 值）用于计算样品之间表达的倍数变化，以|log2（Ratio）|≥1 且FDR ≤0.001 为标准筛选差异表达基因。

1.3.4.4 实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析 使用Primer Premier 5.0 软件设计引物序列（表1），使用LightCycler480 II 型荧光定量PCR仪进行PCR 检测，反应程序为95 ℃，3 min；反应循环45 次，循环过程95 ℃，5 s；60 ℃，30 s。使用2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达水平。

表1 实时荧光定量PCR 引物序列Table 1 The sequences of specific primers used for qRT-PCR analysis

1.4 数据处理

利用Microsoft Excel 2010、Origin 2018、SPSS 17.0 和TBtools 等软件对试验数据进行统计分析及图像处理。

2 结果与分析

2.1 贮藏温度对伽师瓜果实硬度的影响

由图1可以看出，随着贮藏时间的延长，伽师瓜果实的硬度不断降低。0.5 ℃贮藏条件下，伽师瓜硬度下降较为缓慢，且在整个贮藏过程中始终高于3 ℃处理组和21 ℃处理组。贮藏开始时（0 d），伽师瓜果实硬度为1.53 N，贮藏结束时（30 d），0.5 ℃处理组伽师瓜硬度为1.32 N，相对于贮藏前下降了13.7%（P<0.05）；3 ℃处理组伽师瓜硬度为1.28 N，相对于贮藏前下降了16.3%（P<0.05）；21 ℃处理组伽师瓜硬度为1.21 N，相对于贮藏前下降了20.9%（P<0.05）。由此可知，低温贮藏能够延缓伽师瓜的软化，尤其是0.5 ℃贮藏，能够较好的维持伽师瓜的硬度。

图1 不同贮藏温度对伽师瓜果实硬度的影响Fig.1 Effect of different storage temperatures on the firmness of Jiashi melon

2.2 贮藏温度对伽师瓜果实PE、β-Glu 活性的影响

如图2a 所示，伽师瓜果实的PE 活性在贮藏过程中呈先上升后下降的趋势。贮藏12 d 时，21℃处理组的PE 活力最高，为280.53 U/mL，3 ℃和0.5 ℃处理组的PE 活力分别为248.29 U/mL 和241.84 U/mL。贮藏24 d 时，21 ℃处理组的PE 活力显著低于3 ℃和0.5 ℃处理组（P<0.05），同时，0.5 ℃处理组的PE 活力在12 d 和24 d 均低于3℃处理组。

由图2b 可知，常温贮藏下伽师瓜果实β-Glu活性随着贮藏时间的延长呈先上升后下降的趋势。贮藏12 d 时，0.5 ℃处理组和3 ℃处理组的β-Glu 活力分别为10.37 U/mL 和12.04 U/mL，均低于21 ℃处理组，低温会抑制伽师瓜果实β-Glu 活力，这种抑制作用在贮藏后期更为明显。

图2 不同贮藏温度对伽师瓜果实PE 和β-Glu 活性的影响Fig.2 Effect of different storage temperatures on the activity of PE and β-Glu in Jiashi melon

2.3 采后贮藏期间伽师瓜果实转录组分析

与对照组（0 d）相比，不同贮藏温度和不同贮藏时间下的差异表达基因如图3所示。在3 个贮藏温度下，与对照组相比，贮藏24 d 时的差异表达基因数目均高于12 d，并且整个贮藏期间下调表达的基因数目均大于上调表达基因数。12 d 时，3 ℃贮藏条件下的下调表达基因数最多，0.5 ℃贮藏条件下的上调表达基因数最多；24 d 时，0.5 ℃贮藏条件下的下调表达基因数最多，3 ℃贮藏条件下的上调表达基因数最多。结果表明，伽师瓜果实中许多基因的表达水平都受到贮藏条件的影响，并且不同贮藏温度和贮藏时间的影响各不相同。此外，低温动员了更多基因的差异表达，这些基因表达水平的变化，对于调节哈密瓜对冷的应答并保护细胞免受冷害损伤，具有非常重要的作用。

图3 不同贮藏条件下差异表达基因数Fig.3 Number of DEGs in different storage conditions

2.4 21 ℃下软化相关差异表达基因的筛选与分析

从转录组和KEGG pathway 数据库筛选得到33 个β-Glu 基因，32 个β-Gal 基因，31 个PE 基因，9 个PG 基因，7 个EGase 基因和6 个β-Xyl 基因。以上118 个基因表达结果显示，与对照组相比，21 ℃-12 d 组中筛选出14 个显著差异表达基因，21 ℃-24 d 组中筛选出42 个显著差异表达基因（图4）。进一步分析表明，10 个基因在2 个时间点均差异表达（表2），包括3 个EGase 基因（ID：103482819；103493091；103499972），2 个β-Gal 基因（103492646 ；103503132 ），2 个 PE 基因（103483370；103483991），1 个 β -Xyl 基因（103488410），1 个β-Glu 基因 （103492048） 和1个PG 基因（103493318）。这些基因表达水平的变化可能与21 ℃贮藏条件下伽师瓜硬度的变化特性直接相关。

图4 21 ℃下差异表达基因维恩图Fig.4 Venn diagram of DEGs at 21 ℃

表2 21 ℃贮藏条件下伽师瓜软化相关基因表达情况Table 2 Expression of softening-related genes in Jiashi melon at 21 ℃

2.5 3 ℃下软化相关基因的表达水平分析

利用FPKM 法计算基因表达量，以研究温度对采后伽师瓜贮藏期间硬度相关基因表达水平的影响。筛选获得68 个软化相关基因在3 ℃和21℃下表达模式相反（图5），包括18 个PE 基因，22个β-Glu 基因，19 个β-Gal 基因，4 个PG 基因，4个β-Xyl 基因以及1 个EGase 基因。进一步分析表明，与对照组相比，7 个β-Glu 基因，6 个β-Gal基因和3 个PE 基因在21 ℃条件下表达水平无变化，然而在3 ℃下显著下调表达（表3），其中下调倍数最大的是β-Glu 基因103488476 [log2ratio（12 d/0 d）=-3.37；log2ratio（24 d/0 d）=-3.51]。此外，β-Gal 基因（103492389；103492528），β-Glu基因（103489355；103497095），PE 基因（103487960）变化倍数也较大，这些基因的表达变化可能与3 ℃贮藏条件下伽师瓜的硬度变化减缓有关。

表3 3 ℃贮藏条件下伽师瓜软化相关基因下调表达情况Table 3 Down-regulated expression of softening-related genes in Jiashi melon at 3 ℃storage

（续表3）

图5 21 ℃和3 ℃间表达模式相反的差异表达基因热图分析Fig.5 Heatmap of DEGs with opposite regulating patterns between 21 ℃and 3 ℃

2.6 0.5 ℃下软化相关基因的表达水平分析

筛选获得69 个软化相关基因在0.5 ℃和21℃贮藏条件下表达模式相反（图6），其中，包括19个PE 基因，19 个β-Glu 基因，20 个β-Gal 基因，4个PG 基因，5 个β-Xyl 基因，2 个EGase 基因。与对照组相比，16 个软化相关基因在21 ℃条件下表达水平无变化，然而在0.5 ℃下显著下调表达（表4），包括7 个β-Glu 基因，4 个PE 基因，4 个β-Gal 基因和1 个PG 基因。其中，β-Gal 基因（103503204）和β-Glu 基因（103494776）在12 d和24 d 下调倍数均较大，此外，12 d 时β-Glu 基因（103491100）、PE 基因（107992140），以及24 d时PE 基因（103499643）、β-Glu 基因（103502767；103501132；103489355）下调倍数也较大。这些基因可能与伽师瓜在0.5 ℃和21 ℃贮藏下硬度的变化差异直接相关。

图6 21 ℃和0.5 ℃间表达模式相反的差异表达基因热图分析Fig.6 Heatmap of DEGs with opposite regulating patterns between 21 ℃and 0.5 ℃

表4 0.5 ℃贮藏条件下伽师瓜软化相关基因下调表达情况Table 4 Down-regulated expression of softening-related genes in Jiashi melon at 0.5 ℃storage

2.7 3 个温度下硬度相关基因的表达水平分析

筛选21 ℃-3 ℃，21 ℃-0.5 ℃和3 ℃-0.5 ℃组的差异表达基因来评估贮藏温度对软化相关基因表达水平的影响。由图7可知，贮藏12 d 时，在21 ℃-3 ℃，21 ℃-0.5 ℃和3 ℃-0.5 ℃组中均差异表达的基因有10 个，在21 ℃-3 ℃和3 ℃-0.5 ℃组中均差异表达的基因有23 个，在21 ℃-0.5 ℃和3 ℃-0.5 ℃组中均差异表达的基因有25 个。贮藏24 d 时，在21 ℃-3 ℃，21 ℃-0.5 ℃和3 ℃-0.5℃组中均差异表达的基因有17 个，在21 ℃-3 ℃和3 ℃-0.5 ℃组中均差异表达的基因有33 个，在21 ℃-0.5 ℃和3 ℃-0.5 ℃组中均差异表达的基因有35 个。这些基因受贮藏温度的影响差异显著，可能与不同温度贮藏下，果实果胶物质的水解程度直接相关，进而影响果实硬度的变化。

图7 3 ℃-0.5 ℃，21 ℃-0.5 ℃和21 ℃-3 ℃组差异表达基因维恩图Fig.7 Venn diagram of DEGs among the sets of 3 ℃-0.5 ℃，21 ℃-0.5 ℃，and 21 ℃-3 ℃

对在3 个对比组中均差异表达的基因分析可知，贮藏12 d 时，与21 ℃相比，4 个基因在3 ℃和0.5 ℃下调表达，且在0.5 ℃的下调程度高于3 ℃，包括2 个β-Gal 基因（103494366；103503204），1个β-Glu 基因 （103501132）和1 个PE 基因（103483370）（图8a）。同样地，贮藏24 d 时，与21℃相比，4 个基因在3 ℃和0.5 ℃下调表达，且在0.5 ℃的下调程度高于3 ℃，2 个β-Glu 基因（103497772；103501132），1 个 β -Gal 基因（103500059） 和1 个PE 基因 （103483986）（图8b）。

图8 共差异表达基因表达分析Fig.8 Expression analysis of common DEGs

2.8 qRT-PCR 验证分析基因表达

为了验证转录组测序结果，选择6 个软化相关基因进行qRT-PCR 分析，包括2 个PE 基因（103483370；103487960），2 个 β -Glu 基因（103501132；103502767），2 个 β -Gal 基因（103494366；103492528）。结果如图9所示，qRTPCR 验证的基因表达变化趋势与RNA-Seq 鉴定的基因表达趋势一致，表明转录组测序结果具有较高的可靠性。

图9 不同贮藏温度对基因表达量的影响Fig.9 Effect of different storage temperatures on the gene expression

3 讨论

硬度是评价果实品质的重要指标之一，果实软化是硬度降低的外在表现[17]。哈密瓜是典型的呼吸跃变型果实，在采后常温贮藏条件下易发生软化，严重缩短了其货架期，并限制了贮藏和运输[1]。对李子的研究发现低温能够在一定程度上抑制各细胞壁酶的活性，从而影响李子的软化[18]，这与本研究结果一致，在贮藏前期（12 d），低温处理组的PE、β-Glu 活性均低于常温处理组，果胶的降解减慢，伽师瓜的硬度降低较缓。后期21 ℃处理组的PE 活力急剧降低，可能与贮藏后期果实的腐烂有关；β-Glu 主要参与后期的果实软化。此外，通过采前乙酰水杨酸处理[19]和采后1-MCP 处理[7，20]，均可降低甜瓜果实β-Glu 活性，减缓果实硬度的下降。

通过对不同贮藏温度下哈密瓜软化相关基因表达变化的分析可知，低温主要通过调控β-Glu基因、β-Gal 基因、PE 基因以及PG 基因的表达来减缓采后伽师瓜的软化（表3，表4，图8）。在果实软化过程中，PE 和PG 基因表达量较高，参与细胞壁的修饰从而导致果胶降解和果实软化[21]。PE 基因（107992140）在低温（0.5 ℃和3 ℃）下的表达模式与21 ℃相反，并且与对照组相比，该基因在21℃条件下表达水平无变化，然而在低温下显著下调表达；同样地，PG 基因（103492385）在0.5 ℃下显著下调表达，然而在21 ℃下表达水平无变化。这些基因的表达差异可能是低温下哈密瓜硬度维持的主要原因。对杏的研究表明β-Gal 基因的表达峰值时间与最大乙烯产量时间一致，同时1-MCP 处理可抑制其表达[22]。PpBGAL10 和PpBGAL16 是影响乙烯依赖型桃果实软化的主要β-Gal 基因，其下调表达时可通过降低PG 和PE 活性，抑制细胞壁的降解和乙烯的生成，从而延缓桃果实软化[23]。β-Glu 属于细胞壁多糖水解酶类，能与纤维素酶协调作用，在植物细胞生长发育过程中参与细胞壁结构的松弛或加固[24]。Ge 等[25]研究表明β-Glu 在延缓枣果实硬度下降中发挥重要作用。β-Glu 基因DkBG1 的过表达可通过提高脱落酸水平来改变果实成熟度，并通过调节转基因番茄中的可溶性糖水平来影响果实品质。目前，操纵糖苷酶活性和基因转录调控是提高果实品质性状的一种重要策略，在本研究结果中，较多的β-Gal和β-Glu 基因在不同的贮藏条件下显著差异表达，因此，调节β-Gal 和β-Glu 相关基因的表达可能是减少采后伽师瓜硬度损失的重要方法。

4 结论

运用转录组学技术分别对采后0.5，3 ℃和21℃贮藏0，12 d 和24 d 的伽师瓜果实进行转录组分析，筛选得到118 个软化相关基因，结果表明贮藏温度显著影响了软化相关基因的表达水平，低温通过抑制细胞壁酶的活性以及调控软化相关基因的表达，来减缓伽师瓜果实的软化进程。另外，挖掘出了部分调控软化的重要基因，为通过基因操作改善伽师瓜贮藏软化提供支撑。