苦参碱抗白血病作用机制研究❋

杨帆帆， 钟旺景， 马玲娣△

(1.广州医科大学，广州 511436；2.惠州市第三人民医院，广东 惠州 516000)

白血病是起源于骨髓造血干/祖细胞恶性变的一组高度异质性疾病，是十大高发恶性肿瘤之一，儿童和35岁以下的人群占比最高[1]，其特征是白血病细胞在骨髓和其他组织中恶性增殖，伴分化成熟障碍和凋亡受抑，并广泛浸润全身组织器官。临床上出现贫血、出血、发热、免疫低下、骨痛及肝脾、淋巴结肿大等症状[2]。目前临床治疗白血病主要以造血干细胞移植和化疗为主，但移植存在配型困难，需长期服用免疫抑制剂，化疗药毒副作用大，部分患者出现耐药性，甚至出现肿瘤细胞转移或侵袭其他组织器官，导致病情反复发作和恶化，使白血病病人的现状并不乐观，因此开发新的白血病药物和发现药物作用靶点对临床白血病的治疗至关重要。

苦参碱(见图1)是在豆科植物如苦参、苦豆子中提取的一种四环喹诺里西啶类的生物碱成分，化学式为C12H24N2O[3]。苦参碱有4种形态，其中最为常见的为α型，又称α-苦参碱，结晶形状为针晶或棱晶，熔点为76 ℃；β型为单斜棱形结晶，熔点为87 ℃；γ型是液体，沸点为223 ℃/6 mmHg；δ型为棱晶，熔点为84 ℃，可溶于水、苯、氯仿、乙醚或二硫化碳，微溶于石油醚[4]。现代科学研究发现，苦参碱具有抗炎[5]、抗病毒[6]、抗过敏[7]、抗纤维化[8]、抗氧化[9，10]、抗肿瘤[11]等多种作用。苦参碱的抗白血病作用一直是学者关注的热点话题。本文从苦参碱抑制白血病细胞增殖、诱导白血病细胞凋亡、抑制白血病细胞转移侵袭、促进白血病细胞分化、增强免疫细胞功能、影响自噬发生和逆转白血病细胞的多药耐药等方面，对苦参碱抗白血病的药理作用及分子机制进行研究总结，为苦参碱的临床应用提供有益启示和医学参考。

图1 苦参碱的结构示意图

1 苦参碱抑制白血病细胞增殖

原癌基因和抑癌基因的表达失调导致白血病细胞异常增殖，而细胞增殖严格受控于细胞周期。近年来多项研究表明，苦参碱主要通过阻滞细胞G1/S期进程抑制多种白血病细胞系的增殖。王健等[12]研究发现，不同浓度的苦参碱(0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)处理白血病细胞不同时间(24 h、48 h、72 h)，苦参碱以浓度-时间依赖的方式抑制白血病细胞增殖。张莉萍等[13]研究发现，0.1 mg/mL的苦参碱作用于慢性髓系白血病K562细胞株24 h、48 h、72 h后，细胞周期蛋白(Cyclin)E、细胞周期素依赖蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)2、CDK5的蛋白表达水平均提升，G1/S期进程阻滞，细胞增殖率降低。白煜等[14]研究发现，0.5 mg/mL和0.8 mg/mL的苦参碱处理人原代白血病细胞48 h后，G0/G1期细胞比例增多，提示苦参碱抑制细胞周期进程。Asl等[15]研究发现，2.5 mg/mL的苦参碱可通过上调细胞周期抑制因子P21蛋白，miRNA-17、miRNA-20和miRNA-93的表达，阻滞G0/G1、G1/S期的进程，抑制细胞增殖。Ma等[16]研究发现，在白血病细胞中，0.8 mg/mL的苦参碱通过抑制BCR/ABL融合基因介导的胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase/mitogen-activated protein kinase，ERK/MAPK)通路，下调cyclinD1、c-Myc、凋亡抑制基因Bcl-xl、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并上调细胞周期抑制因子P27的蛋白水平，从而抑制白血病细胞的增殖。Ma等[17]还发现，0.5 mg/mL的苦参碱下调磷酸化的信号传导与激活转录因子(Phosphorylation signal transducer and activator of transcription，p-STAT)3和磷酸化的蛋白酪氨酸激酶(Phosphorylation janus kinase，p-JAK)2，显著抑制STAT3的上游激活因子白细胞介素(Interleukin6，IL)6的表达，提示IL-6/JAK/STAT3/通路介导了苦参碱的抗白血病作用。Lin等[18]研究发现，0.5 mg/mL的苦参碱通过c-Myc调控己糖激酶(hexokinase，HK)2的表达抑制糖酵解，进而抑制白血病细胞增殖。综上所述，苦参碱可通过调控细胞周期蛋白cyclinD/E、CDK2/5和细胞周期抑制因子P21、P27的表达，调节ERK/MAPK通路、IL-6/JAK/STAT3等信号通路，抑制白血病细胞的增殖。

2 苦参碱诱导白血病细胞的凋亡

肿瘤的发生发展与细胞的凋亡密切相关，肿瘤的十大特征之一就是抵抗细胞凋亡[19]。多项研究证实，苦参碱可以诱导白血病细胞的凋亡。李瑞等[20]研究发现，0.25 mg/mL、0.5 mg/mL 和 1.0 mg/mL的苦参碱作用于急性早幼粒白血病细胞株NB4时，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspase)3和caspase 8活性增强，提示苦参碱通过caspase途径促进细胞凋亡。Hao等[21]研究发现，0.4 g/L、0.8 g/L、1.2 g/L、1.6 g/L和2.0 g/L苦参碱可以降低白血病细胞中磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylation phosphoinositide 3-kinase，p-PI3K)，磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylation protein kinase，p-Akt)B，磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶点(phosphorylation mammalian target of rapamycin，p-mTOR)的蛋白水平，证实苦参碱通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导急性髓系白血病细胞凋亡。Marjan等[22]研究发现，1.68 mg/mL、3.4 mg/mL和6.75 mg/mL的苦参碱作用于白血病细胞60 min，线粒体膜电位降低、线粒体通透性增加、细胞色素C释放增加、活性氧产生增加、线粒体肿胀，提示苦参碱通过线粒体途径诱导急性B淋巴细胞白血病凋亡。因此，苦参碱可能通过上调促凋亡蛋白和下调抗凋亡蛋白的表达，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路和线粒体功能等方式诱导细胞凋亡。

3 苦参碱抑制白血病细胞的转移和侵袭

侵袭和转移是恶性肿瘤的生物学特征，肿瘤发生侵袭转移是大多数患者死亡的原因。晁荣等[23]研究发现，1.0 g/L的苦参碱下调急髓白血病M3型HL-60细胞的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2和MMP9的mRNA水平，从而抑制HL-60细胞的黏附力、运动力和侵袭力，与3 μM的三氧化二砷联合使用后抑制效果更佳，与张伟等[24]的研究一致。张伟等[25]还发现，在急性淋巴细胞白血病细胞株Jurkat中，0.1 g/L、0.15 g/L和0.2 g/L苦参碱也能明显下调细胞中MMP-9的mRNA水平，显著降低Jurkat细胞的侵袭和黏附能力。聂应明等[26]研究发现，白血病细胞在低氧(3%或5%O2)环境下，缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-α, HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达上调促进血管生成，进而提高细胞的侵袭和转移能力。林淑仪等[27]研究发现，0.2 g/L和0.5 g/L的苦参碱通过下调HIF-1α、VEGF mRNA的表达，有效抑制低氧环境下K562细胞的黏附、侵袭和转移能力。以上结果显示，苦参碱能有效抑制白血病细胞的黏附、侵袭和转移能力，并通过下调MMPs 、HIF-1α和VEGF等的表达。

4 苦参碱促进白血病细胞的分化

白血病细胞的主要特征之一是血液细胞分化成熟障碍，由于全反式维甲酸诱导白血病细胞分化，成功治疗急性早幼粒细胞白血病，使药物诱导分化治疗血液肿瘤成为科学研究的热点之一。胞质型磷脂酶(cytosolic phospholipase, cPL)A2具有降解磷脂膜的作用，其活性增加是诱导细胞分化的一个重要因素。刘北忠等[28]研究发现，200 μg/ml苦参碱处理K562细胞可以显著增强cPLA2活性，从而促进K562细胞的分化。朱付云等[29]研究发现，0.1 mM的苦参碱联合1 μM的全反式维甲酸作用全反式维甲酸耐药的急性早幼粒白血病NB4-R1细胞，可抑制DNA拓扑异构酶(topoisomerase，TOPO)Ⅱβ的蛋白表达，使细胞核质比减小，细胞表面分化抗原(cluster of differentiation, CD)11b升高，从而诱导NB4-R1细胞分化。王健等[12]研究发现，苦参碱处理K562细胞后，联苯胺染色法发现细胞向红系方向分化，以0.05 mg/mL苦参碱作用效果最明显。罗文纪等[30]研究发现，12.5 μg/mL、25 μg/mL和50 μg/mL的苦参碱作用于HL-60细胞72 h，可促进CD11b、CD15的升高，以25 μg/mL苦参碱作用效果最明显，苦参碱处理细胞后细胞体积变小，核质比减小，核扭曲呈肾形，核染色质浓集增粗，核仁消失，提示细胞向粒系分化，与李玉红等[31]的研究一致。与之不同的是，徐建国等[32]研究发现8 mg/ml苦参煎液可使HL-60细胞向单核巨噬细胞分化。以上研究表明，苦参碱可能通过调节cPLA2活性、TOPOⅡβ和细胞表面分化抗原CD11b、CD15的表达等方式诱导白血病细胞分化。

5 苦参碱增强免疫细胞对白血病细胞的杀伤能力

免疫系统是人体的天然屏障，免疫细胞是构成免疫系统的重要因素，尤其是对于肿瘤患者来说，免疫细胞的激活可以杀伤肿瘤细胞，因此通过免疫系统杀伤肿瘤细胞是治疗肿瘤患者的重要途径。Lu等[33]研究发现，0.5 mg/mL的苦参碱抑制K562细胞中IL-6的表达，从而抑制JAK/STAT3通路，上调UL16结合蛋白(UL16 binding protein，ULBP)2的表达，激活自然杀伤细胞(natural Killer cell，NK)对白血病细胞的杀伤作用。Zhang L等[34]研究发现，0.5 mg/mL的苦参碱可上调急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)细胞系和原代白血病细胞中NK细胞活化型受体(natural killer group 2 member D，NKG2D)以及其配体家族(ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表达水平，并抑制CD158、促炎症细胞因子和黏附分子IL-1α、IL-5、IL-6、IL-10、干扰素(interferon，IFN)-γ和肿瘤坏因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的分泌和表达，同时降低炎症介质巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)1a、MIP1b、MMP-9、趋化因子(RANTES)的表达水平，从而调节NK细胞的免疫活性。结合上述研究，苦参碱通过调节NK细胞表面配体蛋白、炎症因子和黏附分子的表达，增强其对肿瘤细胞的杀伤力。

6 苦参碱对白血病细胞自噬的影响

自噬是机体在饥饿、刺激等恶劣环境下，维持机体正常功能的一种自我保护机制，它对细胞的存活和代谢起着至关重要的作用。研究表明，苦参碱可以调节白血病细胞的自噬过程。Wu等[35]研究发现，1.5 g/L的苦参碱处理白血病细胞，可诱导caspase依赖的细胞死亡，促进Akt/mTOR信号通路的磷酸化，从而促进细胞自噬的发生。胡美薇等[36]研究发现，0.4 mg/mL的苦参碱联合0.5 μM的伊马替尼处理K562细胞和伊马替尼耐药细胞株K562/IM，自噬相关蛋白微管相关蛋白Ⅱ轻链3/自噬相关蛋白微管相关蛋白Ⅰ轻链3(autophagy-related protein microtubule-related protein Ⅱ light chain 3/autophagy-related protein microtubule-related protein Ⅰ light chain 3, LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ)的蛋白比例增高，P62蛋白表达水平降低，自噬相关蛋白(autophagy related protein)Becline-1和剪切形式的caspase-3蛋白表达增加，表明苦参碱促进自噬形成，而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可以加强苦参碱对K562/IM细胞诱导的凋亡，自噬诱导剂雷帕霉素抑制苦参碱对K562/IM细胞诱导的凋亡，提示苦参碱诱导的自噬拮抗苦参碱诱导的白血病细胞的凋亡。然而Wang等[37]研究发现,苦参碱可以抑制自噬，当用2 mM的苦参碱处理胃癌细胞SGC7901后，自噬小体增多，进一步研究发现，苦参碱降低组织蛋白酶B和组织蛋白酶D的活性，并促进P62的表达，阻碍溶酶体酸化，损坏溶酶体的功能，进而抑制自噬小体的降解，提示苦参碱可作为一种新型的自噬抑制剂发挥抗肿瘤作用。目前关于苦参碱对自噬的调节仍存在争议，针对苦参碱到底是促进还是抑制自噬有待于进一步的研究和探讨。

7 苦参碱在逆转白血病细胞多药耐药的作用

近年来，由于白血病化疗药物的更新换代，白血病患者病情的缓解率得到显著提高，但在临床多数患者出现耐药性仍是白血病复发和治疗失败的主要原因。为提升药物疗效，联合用药成为治疗白血病的主要策略。Wu等[38]研究发现，0.1 mM的苦参碱可以提高全反式维甲酸耐药细胞株NB4-LR1对雷帕霉素治疗的敏感性。进一步研究发现，苦参碱通过稳定20 S蛋白表达，增强蛋白酶体活性，促进NB4-LR1细胞的泛素化水平，并导致PML RARα融合蛋白的降解。丁艳芳等[39]研究发现，50 μg/mL苦参碱可诱导阿霉素耐药细胞株K562/ADM凋亡，并诱导阿霉素耐药细胞株K562/ADM的凋亡。Chen等[40]研究发现，300 μmol苦参碱可通过激活caspase-3和caspase-9的表达，抑制核转录因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)、Bcl-xl、凋亡抑制基因(survivin)、多药耐药性蛋白(ATP-Binding Cassette sub-family B member, ABCB)1的活性，从而诱导K562/ADR细胞凋亡。上述结果显示，苦参碱可以增强雷帕霉素和阿霉素诱导白血病细胞凋亡的敏感性，逆转其耐药性。

8 未来前景与存在问题

对苦参碱抗白血病作用机制研究的多篇报道，提示苦参碱在抗白血病药理学与分子机制研究中具有重要价值。本课题组多年来一直致力于苦参碱抗白血病的作用机制研究，目前已发现苦参碱可降低白血病细胞IL-6蛋白和转录表达水平，抑制JAK/STAT3通路关键分子JAK2、STAT3蛋白磷酸化及STAT3调控下游基因Bcl-xL、c-Myc和CyclinD1的表达，下调MEK1和ERK1/2磷酸化抑制BCR/ABL介导的Ras/Raf/ERK/MAPK信号通路，减少c-Myc与HK2基因内含子结合而抑制HK2的表达，上调ULBP2的表达增强NK细胞对K562细胞的杀伤，其抗白血病中发挥的作用不可忽视。苦参碱抗白血病的作用靶点也是本课题组一直研究的方向。

分析近年来文献发现，苦参碱具有多靶点、多环节和多效应的特点，可作用于白血病发生发展的多个环节。如阻滞细胞周期进程、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制细胞转移、促进细胞分化、调节细胞自噬和逆转白血病多药耐药等，其分子机制主要包括上调细胞周期抑制因子P21，促凋亡蛋白、细胞表面分化抗原CD11b和CD15等表达；下调促癌基因c-Myc、HK2、CyclinD1、MMP 、HIF-1α、VEGF和抗凋亡蛋白等表达，调节ERK/MAPK、PI3K/Akt/mTOR和IL-6/JAK/STAT3等通路，调节线粒体功能和磷脂酶cPLA2活性，以及调节相关炎症因子和黏附分子的表达。苦参碱抗白血病的分子机制复杂多样，但其最重要的作用靶点尚不明确，仍需进一步的探究。

苦参碱在抗白血病方面具有广泛的作用，其作为中药毒副作用小、较少破坏发育正常细胞，在白血病的治疗中具有广阔的临床应用前景。目前苦参碱的研究还存在一定的局限性，其发挥抗白血病的作用主要体现在体外细胞实验，而在动物实验和临床实验方面的研究还很少；由于苦参碱的特殊结构难以用生物素或荧光基团标记苦参碱进行细胞定位观察，使得苦参碱最关键的作用靶点迟迟未能被发现。苦参碱半衰期短，作用浓度大，限制了其在临床的使用。接下来研究者们需在标记苦参碱以及合成新的苦参碱衍生物上做进一步的探索，借助各种组学技术，通过体外和体内实验相结合，全面阐述苦参碱抗白血病的作用与分子机制。