痛风颗粒对高尿酸血症模型大鼠的作用机制研究❋

蒋 恬， 朱婉华△， 彭江云， 何东仪， 徐智敏， 何 峰， 沙 滨， 孙飞虎， 王鹤潼

(1.南通市良春中医药研究所，江苏 南通 226009；2.南通良春中医医院，江苏 南通 226009；3.云南省中医医院， 昆明 650021；4.上海中医药大学附属光华医院， 上海 200052)

尿酸长期在人体内过度累积可导致痛风，还能增加心血管病的发病风险[1，2]。近年来，我国痛风发病率约为3‰，呈年轻化趋势[3]。目前西医推荐降尿酸治疗的一线药物为别嘌呤醇或非布司他[4]，不良反应较大[5-12]。当前许多研究表明，中药具有明显降低尿酸的作用，并能缓解患者临床症状[13-15]，然而目前对于本病的中医治疗方案还未达成统一。首届国医大师朱良春教授经数十年临床观察研究创制“痛风颗粒”，临床应用于痛风性关节炎、高尿酸血症等疗效显著。本研究拟通过建立高尿酸血症大鼠模型，进一步明确其潜在作用机制。本研究已通过南通良春中医医院实验动物伦理委员会审查(批准号NTLCTCM2019002)。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雄性SD大鼠24只，体质量(220±15)g，购于上海斯莱克实验动物中心，动物许可证号SCXK(沪)2017-0005。饲养于宽敞通风的清洁级动物房，温度20～25 ℃，湿度40%～70%，噪声<60分贝，照明时间L/D=12 h/12 h。适应性饲养1周后进行实验。

1.2 药物

中药痛风颗粒由土茯苓、鬼箭羽、生薏苡仁、徐长卿等组成，南通良春中医医院提供。

1.3 主要试剂及仪器

腺嘌呤 (Sigma，货号A8626)；氧嗪酸钾盐(Sigma，货号156124) ；非布司他(货号SML1285-1G，规格1 g，Sigma)；定制高酵母饲料(北京科澳协力饲料有限公司，质量分数0.1，规格2 kg)；尿酸钠盐(Sigma，货号U2875-25G，规格25 g)；HE染色试剂盒(碧云天，货号C0105S，规格100 mL)。大鼠肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白细胞介素(Interleukin，IL)-1β、IL-4、干扰素(Interferon，IFN)-γ、IL-2、IL-17、IL-13 Elisa试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号分别为CSB-E11987r、CSB-E08055r、CSB-E04635r、CSB-E04579r、CSB-E04628r、CSB-E07451r、CSB-E07454r)。

7150型全自动生化分析仪(日本日立)；RM2035型石蜡切片机(德国LEICA)；ASP300型自动脱水机(德国LEICA)；EG1160型石蜡包埋机(德国LEICA)；CR-GⅢ型高速冷冻离心机(日本Hitachi)。

1.4 高尿酸血症大鼠模型建立

需要造模的大鼠喂养定制高酵母饲料，同时灌胃腺嘌呤，剂量100 mg/kg，每日2次。同时每日用氧嗪酸钾悬液以150 mg / kg的剂量皮下注射2 次，每次间隔12 h，共造模21 d。每日定时尾静脉取血，7150型全自动生化仪检测血浆尿酸水平，连续3 d维持在400 mmol/L即认为造模成功。

1.5 分组与给药

SD大鼠造模成功后平均分为模型组、痛风颗粒组、阳性药物组3组各6只，另设正常组6只。痛风颗粒组按照正常成人剂量以体表面积换算后灌胃给药，给药剂量为17.5 g/(kg·d)，阳性药物组用非布司他以4 mg/(kg·d)的剂量灌胃给药，正常组和模型组用等量纯水灌胃，每天1次，连续给药10 d。

1.6 样本采集与处理

治疗结束后，各组大鼠用3%水合氯醛腹腔注射(1 mL/100 g)进行麻醉，腹主动脉取血，待测相关指标。

1.7 HE 染色观察大鼠关节与肝肾组织病理学变化

取血后取下大鼠关节与肝肾，剥离周围脂肪及膜组织，置于4%的多聚甲醛中固定1 周，石蜡包埋，切片，光学显微镜观察分析。

1.8 生化分析仪检测血浆中尿酸、肌酐和尿素氮水平

用日立-7150型全自动生化分析仪测定血浆中尿酸浓度及肌酐和尿素氮的含量。

1.9 ELISA法检测血浆炎性细胞因子水平

ELISA法检测各组大鼠血浆中TNF-α、IL-1β、IL-4、INF-γ、IL-2、INF-γ、IL-17、IL-13水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 造模前后大鼠尿酸水平的变化

图1示，与正常组比较，模型组大鼠的血浆尿酸水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，提示高尿酸血症大鼠模型建立成功。

图1 正常组和模型组大鼠血浆中尿酸水平比较(n=6)

2.2 各组大鼠关节组织病理染色结果

图2结果表明，正常组大鼠关节组织光滑完整，无炎性细胞浸润和血管增生；模型组大鼠滑膜破裂不完整，有细胞坏死，滑膜周围有炎性细胞浸润且发生水肿。

图2 正常组和模型组大鼠关节滑膜组织染色(HE×200)

2.3 给药后各组大鼠尿酸、肌酐、尿素氮水平比较

表1示，痛风颗粒能有效降低模型组大鼠的尿酸、肌酐、尿素氮水平，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠尿酸、肌酐、尿素氮水平比较

2.4 给药后各组大鼠炎性细胞因子水平比较

表2示，痛风颗粒能显著降低模型大鼠血浆中 TNF-α、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-17的表达水平(P<0.05,P<0.01)。

表2 各组大鼠血浆炎性细胞因子表达水平比较

2.5 给药后各组大鼠肝肾组织病理染色结果

图3、4示，与正常组比较，痛风颗粒组和阳性药物组肝肾组织病理形态结构并无明显变化，血管组织偶见充血改变，表明该中药颗粒对肝肾组织形态和功能无明显毒副作用。

图3 给药后各组大鼠肝组织染色(HE×200)

图4 给药后各组大鼠肾组织染色(HE×200)

3 讨论

痛风以疼痛性关节发炎为特征，最常见于第一个跖趾关节，这是由于尿酸单钠晶体在关节腔内沉淀所致。目前对痛风的疾病诊断采用美国风湿病学院的临床标准，可以通过确定患病关节滑液中尿酸单钠晶体来确诊[16]。目前高尿酸血症、痛风的患病率逐年增加，且病情反复率高，对健康有着很大威胁[17]，降低尿酸水平是避免痛风发作的关键。目前，别嘌呤醇和非布司他是预防复发性痛风的明星药物，故本文选用非布司他作为阳性药。由于西药的副作用较大，探索研发降低尿酸、缓解疼痛、控制炎症、改善心肝肾功能、安全性好、副作用低的中医疗法和中药制剂，具有十分重要的意义[18]。

中医药治疗高尿酸血症和原发性痛风的报道较多[19-21]，多采用辨证分型与固定方加减治疗，治疗原则有清热利湿、通络止痛、温经散寒、除湿通络、益气健脾、泄浊祛瘀等。朱文静等[22]研究得出菊苣可以很好地改善大鼠“脾虚痰湿”的证候学特征；有研究表明，四妙丸提取液可以通过激活肾有机离子转运蛋白，发挥促进尿酸排泄的作用[23，24]。朱良春教授经过数十年临床观察，发现患该病人群特征鲜明，多为年长、体胖或喜饮酒嗜肥甘厚味者，其病症特点为关节异常疼痛，夜间更易发作且有结节等。朱良春[25，26]认为中医虽有“痛风”一名，实为广义的风湿疾病，非西医所言之痛风，病名虽同但概念则异，不应一概而论。此病的诱因为受湿受寒，其主因为湿浊瘀滞内阻。古人云：“症似风而本非风”“乃浊毒瘀滞使然”，且此湿浊之邪不受之于外，而生之于内。在这一理论基础上首创“浊瘀痹”的痛风中医病名，倡导从“浊瘀内阻”角度认识痛风的发生、发展、转归和防治规律，并创立 “泄浊化瘀调益脾肾”的中医治法，同时创制代表方“痛风颗粒”，临床应用于痛风性关节炎、高尿酸血症等疗效显著。

本研究结果表明，痛风颗粒能明显降低模型大鼠血浆中 TNF-α、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-17的表达水平。且HE染色结果显示，中药痛风颗粒对大鼠肝肾组织无明显的损伤作用，说明中药痛风颗粒是治疗高尿酸血症的高效药物，能在降低高尿酸血症模型大鼠尿酸水平的同时，降低大鼠体内肌酐、尿素氮水平，对尿酸盐积累导致的肝肾损伤有一定的保护作用，还能通过有效降低TNF-α、IL-1β、IL-2等炎性细胞因子的过量表达，最终达到减轻肾组织炎症的效果。这些数据都为痛风颗粒临床治疗高尿酸血症提供了科学依据。