冷诱导RNA结合蛋白在体外循环期间导致急性肾损伤机制实验研究

范 阳，刘展会，豆涛涛，张西安

(1.西安医学院，陕西 西安 710021；2.西安市第九医院，陕西 西安 710054)

大多数心脏手术都离不开体外循环(Cardiopulmonary bypass,CPB)。然而，在CPB 过程中，白细胞介素(Interleukin，IL)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)、激肽释放酶和缓激肽等炎症因子的表达显著升高[1]，这会加剧CPB过程中的炎性反应并导致严重的并发症[2-3]。其中，急性肾损伤(AKI)与其密切相关[4-6]，也是最严重、最常见的并发症之一。从临床数据来看，心血管手术患者中5%～30%患有AKI，这些患者的病死率明显升高。同时，也给社会带来了严重的公共卫生负担和巨大的公共资源消耗。

冷诱导RNA 结合蛋白(Cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)属于冷休克蛋白家族，是在哺乳动物细胞中发现的第一个冷休克蛋白。它在多种组织中以低水平表达，但在低温和缺氧等环境中显着上调[7-8]。在缺血再灌注损伤中，CIRP蛋白可以从细胞核转移到细胞质中，并逐渐释放到细胞外。细胞外的CIRP可以作为一种新的损伤相关模式分子(Damage-associated molecular pattern，DAMP)来激活Kupffer细胞并促进炎性反应[9]。CPB期间的心肌缺血再灌注可诱导活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生，而且肾脏的线粒体含量仅次于心脏，是线粒体含量第二丰富的脏器，这可能通过上调促炎转录因子引起炎症并增加AKI的风险[10-12]。Liu等[13]报道CPB患者CIRP水平显著升高，是术后AKI的独立危险因素。另有研究发现，分泌型CIRP主要通过识别 TLR4-MD2复合物来产生炎症因子和趋化因子，从而激活细胞内炎症信号通路，进而引起非特异性炎性反应。因此，我们推测在心脏骤停期间可能会分泌大量CIRP，然后在再灌注后释放到循环中。这些分泌的CIRP可以作为DAMP诱导全身炎症并促进AKI的发展。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞：大鼠心肌细胞系H9c2(批号：CL-0089),大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E(批号：CL-0174)。

1.1.2 药品及试剂：BCA蛋白试测定剂盒(批号：P0012S)；4%多聚甲醛(批号：441244)；DMEM(批号：S9020)；胎牛血清(批号:T8150)；胰蛋白酶(批号:31600)；C23(批号：BP022069)；发光液(货号：1705061)；冷诱导RNA 结合蛋白抗体(anti-CIRP，批号：ab191885)；缺氧诱导因子1α抗体(anti-HIF-1α，批号：ab179483)；TOLL样受体4抗体(anti-TLR-4，批号：ab22048)、髓样分化初级应答基因-88抗体(anti-MyD88，批号：ab133739)、半胱氨酸蛋白酶-3抗体(anti-caspase-3，批号：ab32351)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体(anti-GAPDH，批号：ab8245)、DAPI染色试剂(批号：ab104139)；凋亡蛋白bax抗体(anti-bax，批号： ab216494)、凋亡蛋白bcl2抗体(anti-bcl2，批号：ab32124)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(批号：CASP3C)；0.5% Triton X-100 (批号：0219485483)，1%牛血清白蛋白 (批号：36104ES25)；CIRP检测试剂盒(批号：SEG886Hu)；IL-6检测试剂盒(批号：SEA079Ga)；TNF-α检测试剂盒(批号：SEA133Si)。

1.1.3 主要仪器：超低温冰箱、细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；紫外分光光度仪(日本岛津公司);凝胶成像系统(美国Bio-Rad Laboratories公司);荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：大鼠心肌细胞系H9c2在添加有10% FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基中培养。将细胞接种在6孔板中，每孔密度为5×105个细胞。将细胞分为以下四组：常温(37 ℃)常氧培养2 h(NN组)，低温(15 ℃)缺氧(1% O2)培养2 h(HH组)，细胞在低温和低氧条件下培养2 h，然后在常温和常氧条件下培养30 min(HHNN组)，在低温和低氧条件下培养2 h的细胞，加入C23，一种CIRP衍生肽，可阻断CIRP与其受体结合，然后在常温常氧下培养30 min(C23组)。收集不同处理组的培养基。然后将6孔板中密度5×105个/孔的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E分别与四组培养基在常温常氧下培养4 h。

1.2.2 蛋白质印迹：通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对来自每组的等量蛋白质进行电泳并转移到PVDF膜上。将膜与一抗在4 ℃孵育过夜，然后加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，并在37 ℃下孵育1 h。本研究中使用的抗体是 anti-CIRP、anti-HIF-1α、anti-TLR-4、anti-MyD88、anti-Caspase-3 (1∶1000)、anti-bax、anti-bcl2 (1∶1000)，anti-GAPDH(1∶3000)。使用发光液检测蛋白质并通过成像系统观察。

1.2.3 免疫荧光：免疫荧光染色，H9c2细胞在12孔板中生长到80%左右汇合，根据分组进行不同的处理。细胞用PBS洗涤3次，用4%多聚甲醛固定，用0.5% Triton X-100渗透。细胞用1%牛血清白蛋白封闭，并用anti-CIRP(1∶100) 在4 ℃过夜。然后将样品与二抗在37 ℃下孵育1 h，并用DAPI复染。C23被绿色荧光蛋白标记，进入细胞后即可表达，使用荧光显微镜对细胞进行成像。

1.2.4 TUNEL染色：为了在孵育后检测凋亡的NRK-52E细胞，按照制造商的方案进行了TUNEL染色。完成所有程序后，用DAPI对标本进行复染。与没有DNA片段化而显示蓝色核染色的细胞形成对比，当染色为红色时鉴定为凋亡细胞核。TUNEL测定是通过对每个样本5个图像上的3个独立样本的细胞计数来量化，然后使用单个样本的算术平均值进行统计评估。

1.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)：按分组进行不同处理后，收集H9c2和NRK-52E细胞培养基作为待测标本。使用ELISA 试剂盒测定 CIRP、IL-6、TNF-α的水平。所有测定均根据制造商的说明进行。实验独立重复3次。H9c2细胞培养后与NRK-52E细胞培养后IL-6和TNF-α浓度的差异计算为ΔIL-6和ΔTNF-α。

2 结 果

2.1 低温缺氧促进心肌细胞分泌CIRP 为模拟心脏手术中心肌缺血再灌注的过程，将H9c2细胞在15 ℃、1% O2条件下培养2 h，然后在常温常氧条件下培养30 min。结果表明HH组和HHNN组HIF-1α的表达高于NN组。HHNN组CIRP的表达也显著高于NN组，而CIRP在C23组和NN组的表达相似。TLR-4和MyD88的表达趋势与CIRP一致(图1A)。免疫荧光染色显示，NN组、HH组和HHNN组CIRP表达依次升高，但C23组CIRP表达明显低于HH组和HHNN组(图1B)。

A:各组CIRP、TLR-4和MyD88蛋白表达情况;B:各组免疫荧光染色(×400)

2.2 低温缺氧促进心肌细胞炎性因子分泌 低温和缺氧不仅促进心肌细胞分泌CIRP，而且促进炎症因子的分泌。各组培养基中CIRP浓度分别为(104.9±23.8) pg/ml、(170.8±20.9) pg/ml、(245.7±33.5) pg/ml和(146.7±26.6) pg/ml(HHNN与NN,P=0.006，HHNN与C23，P=0.018)。此外，各组培养基中IL-6浓度分别为(20.3±2.1) pg/ml、(33.0±1.9) pg/ml、(47.2±4.0) pg/ml和(26.3±2.3) pg/ml(HHNN与NN，P=0.002；HHNN与C23，P=0.003)。各组TNF-α浓度分别为(16.4±3.0) pg/ml、(46.5±4.1) pg/ml、(70.7±5.1) pg/ml和(35.1±3.6) pg/ml(HHNN与NN，P<0.001；HHNN与C23，P=0.001)。

2.3 低温缺氧心肌细胞分泌CIRP和炎症因子诱导肾小管上皮细胞凋亡 CPB期间，心脏再灌注后释放大量CIRP等炎症因子。使用低温缺氧的H9c2细胞培养基培养NRK-52E细胞，模拟CPB后的肾损伤。TUNEL染色表明HH组和HHNN组的凋亡细胞多于 NN 组和 C23 组(图2A)。四组的凋亡指数分别为0.92%、5.39%、8.36%和1.97%(HHNN与NN，P=0.013;HHNN与C23，P=0.009;HH与NN，P=0.016，图2B)。此外，凋亡基因 cleaved caspase-3和bax在HH组和HHNN组中的表达高于NN组和C23组，而凋亡抑制基因bcl-2在HH组和HHNN组中低表达(图2C)。另外CIRP还刺激了NRK-52E细胞的炎性反应。HHNN组TLR-4和MyD88的表达高于NN组和C23组。各组NRK-52细胞分泌的ΔTNF-α浓度分别为(4.9±0.2) pg/ml、(16.5±4.0) pg/ml、(15.7±3.6) pg/ml和(8.8±2.2) pg/ml(HHNN与NN，P=0.034，HH与NN，P=0.038，图2D)。各组ΔIL-6浓度分别为(8.4±1.5) pg/ml、(9.4±3.0) pg/ml、(12.1±0.7) pg/ml和(7.2±1.0) pg/ml(HHNN与NN，P=0.032;HHNN与C23，P=0.004，图2E)。

A:各组TUNEL染色(×200)；B：各组细胞凋亡指数；C：各组相关因子蛋白表达情况；D、E：各组培养基中△TNF-α、△IL-6浓度。两者比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨 论

已知细胞内CIRP和细胞外CIRP具有不同的功能,细胞内CIRP充当RNA伴侣以协调与应激源相关的翻译，而细胞外CIRP充当新的DAMP以促进和放大炎症级联[13]。在许多以无菌炎症为特征的缺血再灌注模型中，CIRP的血清和组织水平也显著升高。Zhou等[14]发现，大脑中动脉闭塞后小鼠脑中CIRP升高，并随着缺氧时间增加分泌到细胞外，同时TNF-α表达上调，而CIRP缺陷小鼠的同一模型中TNF-α的表达和小胶质细胞的活化显著降低。Cen等[15]研究表明，CIRP的缺乏可以减轻炎症和氧化应激，并减轻肾缺血再灌注后的肾损伤。

先前的研究表明，CIRP 与参与NF-κB激活的细胞表面受体TLR4-MD2复合物具有强结合力，激活细胞内炎症信号通路产生炎症因子与趋化因子，进而引起非特异性炎症反应[13]，而 TLR4缺陷小鼠对重组 CIRP 蛋白刺激诱导的炎性反应显著弱于野生型小鼠。在组织骨折模型中，CIRP 可通过TLR4/MyD88 通路激活 NADPH 氧化酶引起 ROS 释放，并活化核酸内切酶 G 致使线粒体碎片化，最终介导巨噬细胞自噬与程序性坏死[16]。在本研究中，我们发现心肌细胞在低温缺氧的情况下会分泌大量的CIRP。一方面，这些CIRP激活心肌细胞的炎症反应，并通过TLR-4/MyD88途径释放TNF-α和IL-6。另一方面，分泌的CIRP等炎症因子作用于肾小管上皮细胞，诱导其凋亡。C23与CIRP 序列全长的15聚体肽重叠，对MD2具有高亲和力。它阻断了CIRP介导的促炎反应，减少了对肾小管上皮细胞的损伤。

HIF-1在缺氧环境中的作用已被广泛研究。大量信号分子由HIF-1 DNA结合转录诱导，从而增加细胞氧合并增强对缺氧条件的代谢适应。目前关于缺氧条件下HIF-1α与CIRP关系的研究较少。Wellmann证明CIRP通过一种不依赖HIF-1的机制在缺氧时适应性地表达。Chen等[17]发现，在体内和体外慢性低压缺氧条件下，HIF-1α均显著升高，并介导神经元凋亡。然而，CIRP 的过表达抑制了缺氧时 HIF-1α的上调，并抑制了缺氧诱导的神经元凋亡。在我们的研究中，CIRP 和 HIF-1α 的表达在暴露于低温和缺氧的心肌细胞中增加，并且在C23给药后HIF-1α和CIRP的表达受到抑制。在癌症研究中也有类似的结果。Lu等[18]报道CIRP可以通过结合其 mRNA 的3’-UTR来诱导HIF-1α的表达，从而增加膀胱癌细胞中 mRNA 的稳定性。Yang等[19]还证明HIF-1α是Uni Gene 3’-UTR数据库中 CIRP 靶向转录物之一。有趣的是，CIRP 的表达在复温和复氧后继续增加。在大鼠体外循环模型中发现了类似的结果。CIRP的表达在心跳恢复后的复温阶段继续增加[20]。相关机制还有待进一步研究。

综上所述，心脏手术过程中，心肌细胞不可避免地需要经历低温缺氧的过程。我们的研究结果表明心肌细胞在低温和缺氧条件下分泌大量CIRP，并在复温和复氧后诱导炎症因子的产生。分泌的CIRP可介导炎症级联反应并促进肾小管上皮细胞凋亡，进一步的结论需要更多的动物实验结果来证明。