聚乙烯、聚丙烯微塑料致雄性小鼠生殖毒性的联合效应

王洪艳，李 环，张 晶

(北华大学公共卫生学院，吉林 吉林 132013)

环境污染在诱发男性不育中起着重要作用，微塑料作为一种新型污染物近年来受到国内外广泛关注.微塑料(MPs)是粒径小于5 mm的塑料碎片，研究[1-3]表明：在海洋、河流、空气、饮用水、食物中均可检测到MPs，近年来在人类粪便样本中也发现了MPs的踪迹[4]，MPs的广泛污染及其对人体健康的影响已不容忽视.微塑料的主要组成成分为聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚酯类(PET)等聚合物.目前，MPs对生物体影响的研究多集中于水生生物或探讨单一种类微塑料的毒性作用[5-6]，在实际生活中常常是多种微塑料物质同时接触机体，对各物质间联合效应的研究更具有实际价值.本研究选择PE、PP两种常见的微塑料成分作为受试物，探讨二者对雄性小鼠生殖功能的联合毒性效应.

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

PE、PP粉末过100目网筛后，制成粒径小于150 μm的微塑料(广东胜浩塑胶原料有限公司)；小鼠血清黄体生成素(LH)、卵泡刺激素 (FSH)、睾酮(T)放免试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总蛋白(TP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；WLJY-9000 彩色精子质量检测系统(北京伟力新世纪科技发展有限公司).

1.2 微塑料联合染毒动物模型建立

清洁级6周龄C57BL/6雄性小鼠(吉林大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(吉)2010-0005)32只.适应实验环境1周后随机分为4组：阴性对照组、微塑料PE染毒组、微塑料PP染毒组及微塑料PE和PP联合染毒组.微塑料组喂饲添加1%PE或/和1%PP的塑料颗粒饲料.对照组喂饲正常饲料.连续喂养60 d后称重，各组小鼠眼球取血，室温静置后2 500 r/min离心15 min，取血清，置4 ℃冰箱保存.脊髓脱臼处死动物后，取睾丸称重，并计算睾丸脏器系数.

1.3 小鼠精子质量分析

取小鼠双侧附睾，用预热的生理盐水清洗后放入盛有适量37 ℃生理盐水的平皿中，将附睾纵向剪1～2刀，温育1～2 min，制备精子悬液.将精子悬液滴加到预温的精子计数板上，应用WLJY-9000型精子质量检测系统行精子质量分析.取4个视野，于2 min内完成检测.检测指标包括精子密度 (1×106个/mL)、精子活力(%)、总畸形率(%).

1.4 小鼠血清性激素水平检测

各组小鼠血清中睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)的含量采用ELISA试剂盒检测，按照试剂盒说明书进行操作.

1.5 睾丸组织氧化指标测定

每只小鼠取单侧睾丸组织，放入置于冰水的玻璃匀浆管中，加入9倍体积的生理盐水，用组织匀浆机(2 500 r/min)上下移动将组织研磨均匀，制成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液低温保存.按照试剂盒说明书分别测定上清液中总蛋白浓度、MDA含量及CAT、SOD活性.

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 微塑料对小鼠体质量、睾丸质量及睾丸脏器系数的影响

喂饲60 d后，微塑料单独及联合染毒组小鼠体质量、睾丸质量、睾丸脏器系数与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).见表1.

表1 各组小鼠体质量、睾丸质量及脏器系数

2.2 微塑料对小鼠精子质量的影响

与对照组比较，PE和PP单独染毒组的精子密度和精子活力差异无统计学意义(P>0.05)，而在精子畸形率方面则表现为增高(P<0.05)；PE+PP联合组精子密度和精子活力下降(P<0.05)，精子畸形率增加(P<0.05)；联合染毒组各指标与单独染毒组比较差异显著(P<0.05).见表2.

表2 各组小鼠精子密度、精子活力和精子总畸形率

联合作用析因分析表明：微塑料PE和PP联合喂食后对小鼠精子密度(F=4.767，P=0.038)、精子活力(F=4.400，P=0.045)的影响存在交互作用.图1、图2所示：两条量-效曲线随剂量增加而远离，提示微塑料PE和PP联合喂食可使小鼠精子密度减少(精子活力降低)，具有协同作用，即二种微塑料联合喂食引起的精子密度减少(精子活力降低)作用要大于各自单独喂食时引起的精子密度减少(精子活力降低)作用之和.

图1 微塑料PE和PP联合染毒精子密度分析

图2 微塑料PE和PP联合染毒精子活力分析

2.3 微塑料对小鼠血清生殖激素的影响

与对照组比较，联合组小鼠血清睾酮(T)、黄体生成素(LH)下降，卵泡刺激素(FSH)上升(P<0.05)；单独染毒组与对照组比较，除FSH水平上升外(P<0.05)，其他激素水平差异不显著(P>0.05)；与单独染毒组比较，联合染毒组作用更明显(P<0.05).联合作用析因分析表明：微塑料PE和PP联合应用后在降低睾酮(F=4.278，P=0.048)生成方面存在协同作用.见表3.

表3 各组小鼠血清生殖激素水平

2.4 微塑料对小鼠睾丸组织氧化应激作用

微塑料单独及联合染毒均可降低睾丸组织SOD、CAT的活性，增加MDA的含量，与对照组比较差异显著(P<0.05)，而且联合染毒组比单独染毒组作用更明显(P<0.05).析因分析表明：微塑料PE和PP联合使用后在升高MDA(F=6.438，P=0.017)含量方面存在协同作用.见表4.

表4 各组小鼠睾丸组织中氧化应激指标

3 讨 论

许多毒理学实验[7-10]已证实：MPs对海洋和淡水动物的健康有不利影响，可导致受试水生物发生代谢改变、生长受阻、内分泌紊乱、生殖能力降低、氧化应激、炎症反应、发育异常和细胞死亡等.动物实验[11-12]表明：MPs经口吸收后可以在肝脏、肾脏、肠道、心脏、肺、脾、睾丸等器官中积累，可能引起多器官毒性.相关研究[13-15]证实睾丸是MPs的靶器官，可导致血睾屏障破坏、睾丸脏器系数降低、小鼠精子数量和活力下降、精子畸形率升高等毒性作用.本研究结果显示：与对照组比较，微塑料PE、PP无论是单独还是联合染毒，对小鼠的体质量、睾丸质量、睾丸脏器系数影响不明显，这与文献报道[16]不符，分析原因可能是由于染毒微塑料种类、粒径大小、剂量、染毒途径、染毒周期以及模型鼠属性不同所致.精子质量分析显示：微塑料PE、PP联合染毒在减少小鼠精子密度、降低精子活力方面具有协同作用，在增加精子畸形率上虽无交互作用，但单独染毒与联合染毒组都可使精子畸形率升高，精子质量降低.

为进一步阐明微塑料对雄性动物生殖的影响，本研究又通过分析下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)反馈回路中雄性生殖激素的分泌情况以揭示微塑料对下丘脑-垂体-性腺轴的影响.精子发生依赖于FSH、LH和T的比例，垂体促性腺激素细胞受到下丘脑中促性腺激素释放激素(GnRH)的刺激，后者释放LH和FSH，LH和FSH能够调节动物的精子发生[17].本实验结果表明：与对照组比较，PE+PP联合染毒组小鼠血清LH、T的浓度显著降低，FSH水平升高(P<0.05).联合作用分析结果显示：微塑料PE、PP联合应用后具有协同减低血清中T浓度的作用，从而降低睾丸的精子发生功能，与联合染毒组精子密度结果协同减少相符合.SUN L等[18]也证明了微塑料导致的生殖中断是由于促性腺激素释放激素的正常功能受到干扰.由于HPG轴主要控制生殖系统的功能，因此，微塑料联合作用诱导的血清睾酮水平的变化可能是由于HPG轴受到干扰而发生的.

氧化应激是男性不育的主要原因之一，可诱导睾丸生殖毒性[19].CAT、 SOD的活性间接反映了机体清除活性氧(ROS)的能力，MDA是细胞内氧化损伤积累的脂质过氧化的终产物，其含量可以间接反映机体内脂质过氧化的强度和ROS对组织细胞的损伤程度.本研究中，微塑料PE、PP单独或联合染毒均可诱导小鼠睾丸脂质过氧化产物 MDA 的形成，并抑制抗氧化酶 CAT 和 SOD 的活性.CAT抗氧化酶是机体抗氧化损伤的第一道防线，它通过减少 ROS 的产生而保护DNA、脂质和蛋白质免受损害.SOD 酶将超氧自由基催化为 H2O2和O2，通常情况下，抗氧化酶可以消除由ROS产生的毒性.当ROS过度产生时，超过机体抗氧化系统能力，就会导致氧化损伤.睾丸对ROS特别敏感，有研究[20]报道，5 mm的微塑料就可引起小鼠睾丸发生氧化应激.ROS的过量产生会导致精子膜的黏度和渗透性的破坏，同时还可影响精子细胞的线粒体，使ATP的生成减少，从而损害鞭毛的功能，导致精子活动力下降[21].本研究析因统计分析结果表明：联合染毒组的氧化损伤效应明显高于单独染毒组和对照组(P<0.05)，微塑料PE、PP在升高MDA水平上具有协同作用，氧化应激结果与联合组使精子活力协同降低结果相一致.说明微塑料PE、PP共同作用是通过降低抗氧化酶系统的活性使睾丸组织中蓄积更高水平的ROS，进而引起氧化应激性睾丸毒性，降低了精子质量.

综上所述，微塑料PE、微塑料PP在降低精子数量和精子活力、增加睾丸组织MDA含量、降低睾酮生成方面存在协同作用，可导致雄性小鼠的生殖损伤，初步认为其机制与氧化应激及干扰生殖内分泌功能有关，但具体的相关协同机制还需进一步探讨.

致谢：本文是国家级大学生创新项目(201910201025)研究成果的一部分，公共卫生学院预防医学专业2016级钱鸿昊、2017级刘天祥同学参加了本实验研究工作.