基于网络药理学探讨五苓散防治高脂血症的作用机制*

罗雪霞, 王思敏, 陈紫航, 杨艳红，雷自立

(1.广东药科大学附属第一医院(临床医学院)，广州 广东 510080；2.广东药科大学中医药研究院)

高脂血症(Hyperlipidemia)属于代谢综合征之一[1]。我国成人血脂异常发病率为34.0 %，男性发病率41.9 %，女性发病率32.5 %[2]。高脂血症与冠心病、脑中风、高血压等心脑血管疾病高病死率的形成过程密切相关[3]，已成为一个亟须解决的社会公共卫生问题。他汀类、贝丁酸类、烟酸类、树脂类是目前临床上应用较多的治疗高脂血症的药物[4], 其中最普遍应用的他汀类药物有可能引起肌肉毒性、糖尿病高发风险、肝酶异常以及出血性脑卒中等不良反应[5]。中药因具有辨证施治、多靶点起效、不良反应少等特点，在高脂血症的防治中具有天然优势。因此，进一步挖掘高脂血症发生的病理机制，寻找多靶点、高效、低毒的防治高脂血症药物具有重要意义。

五苓散出自“医圣”张仲景所著的《伤寒杂病论》，由猪苓、茯苓、泽泻、白术和桂枝五味药组成，在临床可用于防治高脂血症[6-9]。

由于中药复方具有多成分、多靶点等特点，导致了在研究其作用机制时存在困难[10]。而网络药理学是基于系统生物学，通过检索网络数据库、利用多种信息化分析工具来构建生物、基因之间关系网络图的一门新兴学科[11]。中医研究的整体观、辨证论治与网络药理学的整体性和系统性是一致的，网络药理学在中医研究中的应用已成为一种趋势[12]。近年来，众多学者采用网络药理学方法对复方中药治疗高脂血症、糖尿病以及高血压等多种疾病进行了研究[13-15]。本研究使用网络药理学相关数据库，预测五苓散防治高脂血症活性成分、作用靶点及作用机制，以期为五苓散防治高脂血症提供新的思路。

1 资料与方法

1.1高脂血症靶点信息收集 在Drugbank 数据库(https://go.drugbank.com/)和DisGeNET数 据 库 (https://www.disgenet.org/) 检索与高脂血症相关的靶点基因，并且将靶点基因导入Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/) 进行基因标准化后归纳整理。

1.2相关中药成分收集 基于药代动力学参数，分别以“猪苓”、“茯苓”、“白术”、“泽泻”、“桂枝”为关键词在中药系统药理学数据库与分析平台数据库( TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) 按照口服生物利用度(OB)≥ 30 %，类药性(DL)≥0.14条件筛选有关中药的有效成分[16]。

1.3相关中药成分靶点预测 将收集到的各个中药的有效成分导入PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)或ALOGPS 2.1 (http://www.vcclab.org/web/alogps/)，查询各成分的SMILE结构，通过 SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/) 收集有效成分的作用靶点，并导入Uniprot数据库进行基因标准化。

1.4五苓散防治高脂血症靶点收集 将五苓散靶点和高脂血症靶点导入 Excel 表格，通过查找重复值找出共同靶点，即为五苓散防治高脂血症的可能靶点。将五苓散治疗高脂血症的交集靶点导入STRING数据库，构建交集靶点间相互作用关系PPI图。将PPI图导入Cytoscape 3.2.1进行可视化与网络拓扑分析，并根据自由度对关键靶点进行筛选。自由度(degree)表示网络中与该节点直接相互作用的节点的数目，degree值越高，则该节点在网络中的作用越重要。

1.5分子对接验证 在ZINC数据库(http://zinc.docking.org/)中查询“1.3”项筛选获得的五苓散防治高脂血症有效成分，在PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中查询并下载“1.4”项筛选获得的五苓散防治高脂血症靶点的3D结构，使用AutoDockTools对靶点蛋白进行加氢等预处理。运行AutoDockTools对有效成分和靶点蛋白进行对接，以最低结合能作为分子对接的结果，结合能<0提示有效成分与靶点蛋白能发生自发结合，结合能≤5提示有较强的结合能力[17]。

1.6生物学功能和通路分析 将五苓散与高脂血症的共同靶点导入DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) ，选择物种智人(Homo sapiens)，进行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia Of Genes and Genome)分析。利用ImageGP 工具(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/) 绘制五苓散防治高脂血症的相关分析图或通路图。

2 结果

2.1高脂血症靶点信息收集和筛选 利用Drugbank 数据库和DisGeNET数据库检索与高脂血症有关的靶点基因，分别得到24个、472个高脂血症靶点，并且导入Uniprot数据库进行基因标准化后归纳整理，得到452个高脂血症的潜在靶点。

2.2相关中药成分收集和筛选 在TCMSP数据库收集猪苓、茯苓、白术、泽泻、桂枝化学成分，其中猪苓有31种、茯苓有34种、白术有55种、泽泻有46种、桂枝有220种。基于OB≥30 %、DL≥0.14条件筛选中药有效成分，得到猪苓11个、茯苓15个、白术10个、泽泻12个、桂枝10个有效成分(表1)，总共得到54个五苓散有效成分，其中包含4个共有成分，茯苓与猪苓共有成分为cerevisterol和stellasterol，桂枝与泽泻共有成分为3-epi-beta-sitosterol，桂枝与猪苓共有成分为peroxyergosterol。

2.3相关中药成分靶点预测 将收集到各个中药的有效成分导入PubChem数据库或ALOGPS 2.1查询各成分的SMILE结构，通过SwissTargetPrediction数据库收集有效成分的作用靶点，并且导入Uniprot数据库进行基因标准化，得到552个五苓散的有效成分的作用靶点。将五苓散54个有效成分的作用靶点分别与452个高脂血症疾病靶点导入 Excel 表格，通过查找重复值找出共同靶点，其中47个五苓散有效成分的作用靶点与高脂血症靶点有交集，即五苓散47个有效成分与防治高脂血症有关，其中4个共同成分均与防治高脂血症靶点相关。

2.4五苓散防治高脂血症靶点收集 将452个高脂血症疾病靶点与552个五苓散有效成分作用靶点绘制韦恩图，即五苓散治疗高脂血症的交集靶点(图1)，由此可筛选得到五苓散治疗高脂血症的潜在靶点84个。

表1 五苓散有效成分

将五苓散治疗高脂血症的交集靶点导入STRING数据库，构建交集靶点间相互作用关系PPI图(图2)，有84个节点和652条边，平均节点度为15.5，平均局部聚类系数为0.531。将PPI图导入Cytoscape 3.2.1进行处理，以节点的大小和颜色的深浅反映degree值的大小。节点越大、颜色越深，对应的degree值越大，则该节点在网络中的地位越重要。经计算得网络平均degree值为15.71，以大于平均degree值的2倍为条件对PPI网络进行二次筛选[18]，最终获得8个关键靶点，分别为AKT1、IL-6、TNF、MAPK1、IL1B、PTGS2、PPARG和EGFR。

图1 五苓散治疗高脂血症的靶点韦恩图

图2 五苓散和高脂血症共同靶点间相互

2.5分子对接验证 将“2.4”项筛选得到的8个关键靶点与五苓散防治高脂血症靶点数量排名前3的有效成分进行分子对接，得到分子对接的最低结合能(表2)，选择3种有效成分中结合能较低的靶蛋白作分子对接模式图(图3)。除了PTGS2蛋白，其余每1个靶点蛋白至少可与1种有效成分较好结合，3种有效成分均能与大部分关键靶点自发结合。结果表明，五苓散的有效成分可以对关键靶点发挥调控作用。

表2 五苓散防治高脂血症关键靶点与五苓散有效成分的分子对接结果

图3 五苓散防治高脂血症靶蛋白与五苓散有效成分的分子对接模式

2.6生物学功能和通路分析

2.6.1GO分析 将五苓散有效成分和高脂血症的84个共同靶点导入 DAVID 6.8数据库，选择物种智人(Homo sapiens)，得到GO分析295个生物学过程、34个细胞组分、79个分子功能。根据P值筛选前20个生物学过程、细胞组分和分子功能，利用ImageGP工具绘制“五苓散防治高脂血症中的生物学过程(GO-BP)分析”(图4) ，“五苓散防治高脂血症涉及的细胞组分(GO-CC)分析” (图5)，“五苓散防治高脂血症涉及的分子功能(GO-MF)分析”(图6)。

图4 五苓散防治高脂血症中的生物学过程(GO-BP)分析

图5 五苓散防治高脂血症涉及的细胞组分(GO-CC)分析

图6 五苓散防治高脂血症涉及的分子功能(GO-MF)分析

2.6.2KEGG分析 将五苓散有效成分和高脂血症的84个共同靶点导入 DAVID 6.8数据库，选择物种智人(Homo sapiens)，得到102条KEGG通路。根据P值筛选前20条通路，利用ImageGP工具绘制“五苓散防治高脂血症通路(KEGG)”(图7)。进一步通过DAVID 6.8数据库分析了VEGF信号通路图(图8)和AMPK信号通路图(图9)。

图7 五苓散防治高脂血症通路(KEGG)

图8 VEGF信号通路

图9 AMPK信号通路

3 讨论

本研究通过两个数据库收集得到高脂血症的452个靶点，提示高脂血症的发生可能由多个靶点共同导致。通过筛选，收集到五苓散54个有效成分，其中47个有效成分与防治高脂血症靶点有关，4个共同成分均与防治高脂血症相关。五苓散有效成分与高脂血症之间存在84个共同靶点，Trametenolic acid、Eburicoic acid、Oleic acid等可能为五苓散防治高脂血症的主要成分，AKT1、IL-6、TNF、MAPK1、IL-1B、PTGS2、PPARG和EGFR等可能为五苓散防治高脂血症的主要靶点。研究表明，从茯苓提取的Dehydro-trametenolic acid 可以激活PPARG，诱导脂肪转化并充当胰岛素增敏剂[19]。Eburicoic acid可以增强骨骼肌中p-AMPK和p-AKT的水平以及增加肝脏p-FOXO1的表达水平，产生降糖作用；并且，Eburicoic acid增加了PPARG的肝脏表达水平，增强脂肪酸氧化，产生降血脂作用[20]。GO功能富集分析结果表明，五苓散防治高脂血症主要涉及一氧化氮生物合成过程的正调控、脂质代谢过程以及类固醇激素介导的信号通路等295个生物学过程；膜筏、胞质溶胶、内质网膜等34个细胞组分；类固醇激素受体活性、酶结合、磷脂酰肌醇3-激酶活性等79个分子功能。KEGG通路富集分析结果表明，五苓散防治高脂血症通路有102条，包括VEGF信号通路与AMPK信号通路等，这些通路互相密切相关，由许多共同基因协调调控，为五苓散防治高脂血症提供了新思路。

血管内皮生长因子(VEGF)家族包括VEGF-A/B/C/D和胎盘生长因子；其受体VEGFR-1/2/3是一种受体酪氨酸激酶，主要分布于内皮细胞、骨髓来源细胞和神经元细胞膜[21]。阜新颗粒可通过TGF-β1/Smad和VEGF/VEGFR2信号通路显著改善小鼠的高血糖和高脂血症[22]。重组 VEGF-B 蛋白抑制小鼠高脂饮食诱导的体重增加，并减少肥胖相关的高脂血症和脂肪肝[23]。淋巴管生成和 VEGF-D 的丧失导致小鼠严重的高脂血症和乳糜微粒残留的清除延迟[24]。因此，五苓散可能通过调节VEGF信号通路影响血脂水平，从而起到防治高脂血症的作用。

腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK) 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，被称为“人类细胞能量的监视器”[25]。卡格列净通过 AMPK 增加肝脏和肠道中 ATP 结合盒转运蛋白的表达，增加胆汁和粪便胆固醇的排泄，改善高脂血症[26]。小檗碱抑制肠道和肝脏中的线粒体复合物I，抑制脂质代谢，从而治疗肥胖和脂肪肝[27]。白杨素可通过调节 HepG2 细胞和小鼠体内的 AMPK/PI3K/AKT 信号通路来改善糖脂代谢紊乱[28]。因此，五苓散可能通过调节AMPK信号通路影响脂质平衡和稳态代谢微环境，如脂肪分解和分化，从而降低高脂血症。

综上所述，五苓散防治高脂血症具有多成分、多靶点、多通路特点，利用网络药理学分析平台对五苓散的有效成分靶点、高脂血症靶点以及五苓散防治高脂血症通路进行预测，对五苓散防治高脂血症的机制研究具有重要意义。