甲型H1N1 流感病毒mRNA 疫苗的制备及其免疫原性评价

马宁 ，年悬悬 ，刘京 ，邓涛 ，张国梅 ，吕传硕 ，乐洋 ，周蓉 ，龚铮 ，张家友 ，杨晓明

1.武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室，湖北 武汉 430207；2.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北 武汉 430207；3.中国生物技术股份有限公司，北京 100029

流行性感冒（简称流感）是一种持续威胁人类生命健康的呼吸系统传染病。据估计，全球每年因季节性流感造成的呼吸系统相关死亡病例为29 万～65 万，其中大部分患者为65岁及65岁以上的老年人或5岁以下的儿童［1］。目前，我国正处于人口快速老龄化及生育政策逐步放开的阶段，防治流感具有重要的公共卫生意义。疫苗接种是预防流感的最有效措施，目前，国内外已上市的流感疫苗主要包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、减毒活疫苗及亚单位疫苗，疫苗形式从单价疫苗发展为三价及四价疫苗，可预防目前主要的流行型别（H1N1、H3N2、B victoria 和B Yamagata）。另有多种新型疫苗正处于研发阶段，如病毒载体疫苗、纳米颗粒疫苗和核酸疫苗等［2-4］。其中mRNA 疫苗是目前研究较多且进展较快速的一类新型疫苗，该类疫苗在动物实验中显示出了良好的安全性和保护效果，已成功应用于多种传染病疫苗的开发，如新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）、狂犬病、流感和寨卡病毒病等相应疫苗，部分疫苗已进入不同临床阶段［5-8］。目前，针对 COVID-19 的两款 mRNA 疫苗 mRNA-1273 和BNT162b2 已被美国FDA 批准上市。

mRNA 疫苗核酸分子结构与真核细胞内成熟mRNA 类似，主要包括 5′帽子、5′非编码区（5′UTR）、开放阅读框、3′非编码区（3′UTR）和 poly（A）尾［9］。由于裸mRNA 易被降解且细胞摄取效率低，需合适的递送系统辅助吸收，常用递送系统主要包括鱼精蛋白、脂质体纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNPs）、聚合物及脂质聚合物混合物等［5，10-12］。与传统疫苗比较，mRNA 疫苗具有诸多优势：①设计灵活，易于规模化生产；②安全性较好，无DNA 疫苗的基因组整合风险且可通过自然途径降解；③生产过程不涉及活病毒操作，无感染性；④疫苗直接在胞内原位产生抗原蛋白，可同时诱导机体产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答［13］。因此，mRNA 疫苗具有较强的新型候选疫苗潜力。本研究通过体外转录合成针对甲型H1N1 流感病毒的HA-mRNA，与LNPs 混合制备成HA-mRNA-LNPs 疫苗，并通过肌肉免疫BALB／c小鼠，评价疫苗的免疫效果，以期为流感mRNA 候选疫苗的研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及细胞 载体pBluescriptⅡSK（+）购自苏州金唯智生物科技有限公司；感受态E.coli TransStbl3 购自北京全式金生物技术股份有限公司；HEK293T 细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；MDCK 细胞（购自 ATCC，ATCC-CCL-34）、H1N1（IVR-180）工作种子批及含有绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因的质粒pCDNA3.1-EGFP由武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室保存，鸡浓红细胞和1%鸡血红细胞悬液由该公司实验动物室提供。

1.2 主要试剂及仪器 Trans2K PlusⅡDNA marker购自北京全式金生物技术股份有限公司；T4 DNA Ligase、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ均购自美国NEB 公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自日本 TaKaRa 公司；PCR 产物纯化试剂盒购自德国QIAGEN 公司；质粒大提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；T7 High Yield RNA Transcription Kit、Cap1 Capping System 及EGFP-mRNA 均购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；假尿嘧啶核苷酸购自美国 Trilink 公司；MEGAclear KitTMPurification for Large ScaleTranscriptionReaction、QubitRNA XRAssaykit 及LipofectamineTMMessen-gerMAXTM均购自美国Thermo Scientific 公司；受体破坏酶和10 000 Da 超滤浓缩管购自美国Sigma 公司；可电离脂质、中性脂质、PEG化脂质、胆固醇及INanoTML 纳米药物制备系统由迈安纳（上海）仪器科技有限公司提供；Qubit4 检测设备购自Thermosientific 公司。

1.3 实验动物 SPF 级 BALB ／ c 小鼠，雌性，6 ～ 8周，体重18 ～22 g，由武汉生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供并饲养，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2017-0013，动物使用许可证号：SYXK（鄂）2014-0012。本实验对小鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照武汉生物制品研究所有限责任公司动物伦理相关规定进行（文件号：WIBPAII312，020，001）。

1.4 模板质粒的构建

1.4.1 质粒 pBluescriptⅡSK（+）-HA 在全球共享流感数据倡议组织（Global Initiative of Sharing All Influenza Data，GISAID）官方网站流感病毒数据库获得甲型 H1N1 流感病毒 IVR-180（A ／ Singapore ／GP1908 ／2015，accession：EPI849451）毒株的血凝素（hemagglutinin，HA）编码序列，进行人源密码子优化后，两端添加XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点，并在优化的目的基因两端分别插入β-globin 的5′UTR 及2个串联重复的 3′UTR，3′UTR 后再加入 1个长度为125 bp 的poly（A）尾。设计序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成，直接构建至载体pBluescriptⅡSK（+）的KpnⅠ和 BamHⅠ酶切位点之间，将质粒转化至感受态E.coli Top10 进行培养。

1.4.2 质粒 pBluescriptⅡSK（+）-EGFP 应用 Primer premier 5.0 软件设计扩增引物，并在上下游引物5′端分别添加XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点；利用高保真酶通过PCR 反应从质粒pCDNA3.1-EGFP 中扩增EGFP 基因。将获得的PCR 产物与质粒pBluescriptⅡSK（+）-HA 分别进行 XhoⅠ和 EcoRⅠ双酶切，回收两者酶切后的大片段，以T4 DNA Ligase 于25 ℃水浴3 h；连接产物转化至感受态E.coli TransStbl3 进行培养。

1.5 质粒的线性化 将含有模板质粒pBluescriptⅡSK（+）-HA 和 pBluescriptⅡSK（+）-EGFP 的 E.coli 分别按 0.1%的比例接种至 200 mL 含 100 μg ／ mL Amp 的 LB 液体培养基中，37 ℃，200 r ／ min 振荡培养过夜；用质粒大提试剂盒提取质粒，进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。鉴定正确的两种质粒均经内切酶BamHⅠ进行单酶切线性化，反应条件为：37 ℃水浴3 h。酶切产物采用PCR 产物纯化试剂盒回收，经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 mRNA 的体外转录合成 分别以两种线性化质粒为模板进行mRNA 的体外转录反应。转录体系为：10 × Transcription Buffer 2.0 μL，ATP ／ CTP ／GTP／UTP（配制时替换为假尿嘧啶核苷酸）各1.5 μL，Enzyme Mix 2.0 μL，模板 1.0 μg，无 RNase 水补足至20.0 μL；反应条件为：37 ℃ 2 h。采用 MEGAclear KitTMPurification for Large Scale Transcription Reaction 试剂盒纯化转录产物。纯化产物于65 ℃加热10 min，迅速冰浴，再进行加帽反应，加帽体系为：10 × Capping Reaction Buffer 2.0 μL，GTP（10 mmol ／ L）10.0 μL，SAM（20 mmol／L）2.5 μL，Recombinant RNase Inhibitor（40 U ／ μL）2.5 μL，mRNA Cap2′-O-Methyltransferase（100U ／μL）4.0 μL，Vaccinia Capping Enzyme（10 U ／μL）4.0 μL，模板 50.0 μg，无 RNase 水补足至 100.0 μL。反应条件为：37 ℃1 h。用MEGAclear KitTMPurification for Large Scale Trans-cription Reaction 试剂盒进行产物纯化，经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.7 表达框架的体外验证 采用LipofectamineTMMessengerMAXTM转染试剂将体外转录合成的EGFP-mRNA 转染至HEK293T 细胞，并以转染试剂作为阴性对照，市售的EGFP-mRNA 作为阳性对照。转染24 h 后置于荧光显微镜下分别在荧光和对应白光视野下进行观察。

1.8 HA-mRNA-LNPs 的制备 将可电离脂质、中性脂质、PEG 化脂质和胆固醇按 46.3 ∶9.4 ∶1.6 ∶42.7的比例溶于无水乙醇，将脂质混合物与含有HA-mRNA 的 50 mmol ／ mL 柠檬酸盐缓冲液（pH 4.0）按 1 ∶3 的比例以 12 mL ／ min 的速度通过纳米药物制备系统制备mRNA-LNPs；制备产物用PBS 进行25 倍稀释，经 10 000 Da 的超滤管离心（2 000 × g，30 min）换液，再通过 0.22 μm 滤膜除菌过滤，即获得HA-mRNA-LNPs，粒径仪分析粒径。用1%的Triton于37 ℃条件下作用10 min，破碎HA-mRNA-LNPs，采用Qubit RNA XR Aassy kit 测定破碎前后RNA 的浓度，并按下式计算mRNA 的包封率。

包封率（%）=（1%Triton 破碎样品mRNA 浓度-未破碎样品 mRNA 浓度） ／ 1%Triton 破碎样品 mRNA 浓度 × 100%

1.9 免疫原性评价

1.9.1 动物免疫 用含 2 和 10 μg HA-mRNA 的HA-mRNA-LNPs 经肌肉分别免疫 BALB ／ c 小鼠，100 μL ／ 只，同时设 LNPs 组（等体积未包裹 mRNA的LNPs）和阴性对照组（等体积PBS），每组6 只。初次免疫后3 周，进行加强免疫，免疫剂量和途径同上；加强免疫后3 周，经小鼠眼眶后静脉丛采血，分离血清。采用血凝抑制（haemagglutination inhibition，HI）试验和病毒微量中和（microneutralization assay，MN）试验分别检测血清中血凝抑制抗体滴度及中和抗体水平。

1.9.2 HI 试验 按1 ∶4 的体积比向血清样本中加入受体破坏酶，37 ℃水浴 16 ～ 18 h；56 ℃水浴灭活30 min；按1 ∶20 的比例加入鸡浓红细胞，吹打混匀，4 ℃静置 1 h；1 250 × g 离心 10 min，取上清，于96 孔V 型板中用PBS 对上清进行2 倍系列稀释（1 ∶10 ～ 1 ∶10 240），加入 4个血凝单位的 IVR-180 流感病毒，25 μL ／ 孔，室温孵育 1 h；加入 1%鸡血红细胞悬液，25 μL ／ 孔，摇匀，室温孵育 30 min。以发生完全血凝抑制的最高稀释度为血凝抑制抗体滴度，并计算几何平均滴度（geometric average titer，GMT）。

1.9.3 MN 试验 将 MDCK 细胞按 1 × 104个 ／ 孔加入 96 孔板，37 ℃，5% CO2条件下培养过夜；血清样本于56 ℃水浴灭活30 min。于另一块96 孔板中用无血清VP 培养基对血清样本进行10 倍稀释，再进行 2 倍系列稀释（1 ∶20 ～ 1 ∶10 240）。加入经TPCK 胰酶（2 μg ／ mL）处理的 200 CCID50／ 100 μL的 IVR-180 流感病毒，50 μL ／孔，混匀，37 ℃孵育 1 h；加至单层MDCK 细胞，继续孵育3 ～5 d，观察细胞病变情况。取 25 μL 上清，加入25 μL 的 1%鸡血红细胞悬液进行血凝试验，红细胞未发生凝集的孔认为病毒被中和，以血清完全中和病毒的最高稀释度为中和抗体滴度，并计算GMT。

1.10 统计学分析 应用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析，组间数据比较采用Mann-Nhitney法，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 模板质粒的鉴定 质粒pBluescriptⅡSK（+）-HA和pBluescriptⅡSK（+）-EGFP的双酶切（XhoⅠ／ EcoRⅠ）产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，分别可见1 719和735 bp 的相应目的基因条带及3 348 bp 的载体条带，大小与预期相符，见图1。测序结果表明，两个模板质粒的目的序列均正确，无变异。

2.2 质粒线性化的鉴定 质粒pBluescriptⅡSK（+）-HA和 pBluescriptⅡSK（+）-EGFP 的单酶切（BamHⅠ）产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，可见5 067 和4 083 bp 的目的条带，大小与预期一致，见图1。

2.3 mRNA 的体外合成 HA-mRNA 和EGFP-mRNA经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见2 185 和1 201 bp 的目的条带，大小与预期相符，且条带单一、无弥散，见图3。表明体外转录成功。

2.4 表达框架的体外验证 EGFP-mRNA 转染24 h后，镜下观察，实验组和阳性对照组均可见明显的绿色荧光蛋白表达，阴性对照组未见荧光，见图3。表明表达框架具有可行性。

2.5 HA-mRNA-LNPs 的鉴定 HA-mRNA-LNPs 平均粒径为70.2 nm，聚合物分散性指数为0.15，表明制备的纳米粒子粒径较小且均一。HA-mRNA-LNPs包封率约为80%。

图2 体外转录mRNA 的电泳图Fig 2.Electrophoretic profile of in vitro transcribed mRNA

2.6 免疫原性评价 与阴性对照组（HI GMT 和MN GMT 分别为 5.000 和 7.937）比较，末次免疫后，LNP组小鼠血清 HI GMT（5.000）和 MN GMT（7.071）差异均无统计学意义（U=15.0，P ＞ 0.05）；2 和 10 μg 剂量组（HI GMT 分别为 2 281 和 4 561，MN GMT 分别为2 032 和 6 451）均显著升高（U = 0.0，P 均 ＜ 0.01）。10 μg 剂量组小鼠血清 HI GMT 及 MN GMT 均显著高于 2 μg 剂量组（U 分别为 2.5 和 2.0，P 分别为 0.013 0 和 0.010 8）。表明 HA-mRNA-LNPs 具有较好的免疫原性，可诱导高水平的中和抗体。

3 讨 论

季节性流感每年可影响全球近1 ／ 10 的人口，造成数十万人死亡。虽然目前已有许多基于不同疫苗平台的流感疫苗上市，但病毒在流行过程中易发生变异，导致流行株与疫苗株抗原性不匹配，影响疫苗整体保护效果。据报道，以往10年内传统流感疫苗的平均保护率仅为 42%（19% ～ 60%）［14］。因此开发一种易于制备且安全有效的疫苗对于流感防控尤为重要。与传统疫苗比较，mRNA 疫苗设计更灵活，易于生产，若出现病毒变异，替换抗原序列即可，无需进行复杂的工艺优化，因此，mRNA 流感疫苗是一种具有较大生产和应用潜力的疫苗形式。

mRNA 易被环境中广泛存在的RNA 酶降解，因此mRNA 的结构组成及递送系统对mRNA 疫苗的表达和稳定性十分重要。德国BioNTech 公司在其专利中将两个β 球蛋白的3′UTR 进行串联，可显著增强 mRNA 的稳定性［15］。ZHUANG 等［16］研究表明，人类 β 球蛋白的 5′UTR 和 2个串联的 3′UTR 可显著增强mRNA 的翻译效率。另外，mRNA 作为一种外源分子本身具有一定的免疫原性，在合成过程中加入假尿嘧啶核苷酸不仅可降低免疫原性，还可提高蛋白的翻译效率［17］。翻译效率和稳定性随着Poly（A）尾长度的增加而提高，长度为120 ～150 nt时更有利于在树突状细胞中的表达［18］，本研究采用β 球蛋白的UTR 区并设计了长度为125 nt 的Poly（A）尾，结果显示，具有较好的翻译效果，获得的HA-mRNA-LNPs 粒子粒径较小且均一，HA-mRNALNPs 包封率约为80%。

在递送系统方面，LNPs 是目前应用最广泛的一种递送系统，其递送效率高、安全性较好，并已在上市的COVID-19 mRNA 疫苗中得到证实［19］。对于mRNA 流感疫苗，最早进入临床的是针对甲型H10N8 和 H7N9 流感病毒 HA 的 mRNA-LNPs 疫苗，其临床前研究结果显示，无论是经皮内还是肌肉免疫，这两款疫苗均可诱导明显高的HI 抗体滴度，且免疫效果相当，剂量为 0.08、0.4、2 和 10 μg 时，H7N9 组各剂量间HI 差异无统计学意义，而H10N8组HI 除0.4 与2 μg 两个剂量差异无统计学意义外，其他剂量均呈显著剂量依赖性增加［20］。本研究将 HA-mRNA-LNPs 分别含 HA-mRNA 2 和 10 μg 的剂量经肌肉免疫BALB ／ c 小鼠，结果表明，与阴性对照组比较，2 和 10 μg 剂量组的 HI GMT 和 MN GMT 均显著升高（P 均 ＜ 0.001），且 10 μg 剂量组均显著高于2 μg 剂量组（P 均 ＜ 0.01），免疫效果较好。另外，ZHUANG 等［16］采用阳离子 LNPs 制备了针对甲型H1N1 流感病毒HA 的mRNA 候选疫苗，以12 μg 的剂量对小鼠进行鼻内免疫，结果显示，该疫苗可诱导明显高水平的HI 抗体滴度。本研究采用可电离脂质制备LNPs，安全性更好，且诱导产生的抗体水平也相对更高。

影响mRNA 疫苗效果的因素较多，如抗原的选择、表达框架的设计、递送系统的选择和优化、免疫剂量和途径的选择等，实现产业化尚需对各工艺环节进行优化，以实现疫苗的安全有效和质量可控。本研究成功制备了针对甲型H1N1 流感病毒IVR-180株的mRNA 疫苗，该疫苗能够诱导BALB ／ c 小鼠产生高水平的HI 抗体和中和抗体，为流感mRNA 候选疫苗的研发提供了实验依据。