云南省柯萨奇病毒A 组6 型全基因组特征分析

张名，冯昌增，刘红波，王晓辉，许丹菡，丛山日，何陆涛，张光贤，马绍辉

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南 昆明 650118

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是一种以婴幼儿发病为主的全球性传染病［1］，柯萨病奇毒（Coxsackievirus，CV）A 组、B 组、肠道病毒 71型（enterovirus 71，EV71）、埃可病毒和其他新型肠道病毒等20 多种肠道病毒均能引起HFMD［2］。EV71和柯萨奇病毒 A 组 16 型（Coxsackievirus A16，CVA16）是引起HFMD 主要病原体，随着EV71 疫苗的上市，引起HFMD 的病原谱也随之发生改变，非EV71型非CV-A16 肠道病毒引起的HFMD 疫情在多个国家或地区相继报道，其中以CV-A6 为主［3］。

CV-A6 作为近年来引起HFMD 的主要致病血清型之一，其属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属，基因组为单股正链RNA，全长约7 400 bp，呈二十面体对称球形颗粒，5′UTR 和 3′UTR 之间编码了 1个包含P1 结构蛋白和P2、P3 非结构蛋白的开放阅读框，其中P1 前体蛋白编码了VP1 ～VP4 4 种结构蛋白，VP4 位于病毒颗粒外壳的内侧与病毒核心连接，VP1 ～VP3 暴露于病毒颗粒表面，包含了主要的抗原决定簇，P2 和 P3 编码 2A ～ 2C 和 3A ～ 3D 7个非结构蛋白［4］。

本研究通过对2015年云南地区4 株CV-A6 进行分离和全基因组特征分析，为HFMD 的预防控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本及细胞 4 份HFMD 患者的粪便样本由昆明市儿童医院提供，于-80 ℃保存；人横纹肌瘤细胞（rhabdomyosarcoma，RD）由中国医学科学院医学生物学研究所冻存并提供。

1.2 主要试剂 MEM 基础培养基、3%谷氨酰胺、6.6% NaHCO3和青-链霉素由中国医学科学院医学生物研究所中心供应室提供；胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；病毒RNA 提取试剂盒（Axygen Body Fluid viral DNA ／ RNA Miniprep Kit）购自美国Axygen 公司；RT-PCR 扩增试剂盒（PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2）购自日本TaKaRa 公司。

1.3 病毒分离培养 将HFMD 患者粪便样本悬液1 500 × g 离心 30 min；取上清，用 0.22 μm 滤膜过滤，取100 μL 加至已长成单层的 RD 细胞中，37 ℃，5% CO2培养箱培养4 ～7 d，每天观察细胞病变（CPE）情况。无论是否出现CPE，7 d 后收获细胞培养上清并反复冻融3 次后，盲传3 代，3 代后仍无CPE 判为阴性，出现CPE 则判为阳性，阳性收获液于-80 ℃冻存备用。

1.4 引物设计及合成 参考本课题组前期已报道的研究设计扩增及测序引物［5］，引物序列见表1，引物合成委托昆明硕擎生物科技有限公司。

表1 全基因扩增及测序引物Tab.1 Primers for amplification and sequencing of complete genome

1.5 目的基因的扩增 按照Axygen Body Fluid viral DNA ／ RNA Miniprep Kit 试剂说明书提取病毒 RNA，以其为模板，利用PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 试剂盒对病毒基因组进行分段扩增。RT-PCR反应条件：50 ℃逆转录 30 min；94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 30 s，52 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 50 s，共35个循环；72 ℃再延伸 5 min。取 PCR 产物 5 μL，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 序列测定及分析 将阳性PCR 产物送昆明硕擎生物科技有限公司测序。从NCBI GenBank 数据库下载国内外54个CV-A6 毒株的VP1 序列，采用Geneious 9.1.4 和Mega 7.0 软件对序列进行分析处理，并用Mega 7.0 软件中的邻近法构建系统进化树，参考 SONG 等［6］对 CV-A6 的分型标准，可靠值根据1 000 bootstrap 值评估。采用肠道病毒分子定型软件Enterovirus Genotyping Tool Version 进行序列定型分析，Simplot 软件进行重组分析。

2 结 果

2.1 全基因组结构分析 共获得4 株分离株，分别命名为 A100 ／ YN ／ CHN ／ 2015（YN-A100）、A18 ／YN ／ CHN ／ 2015（YN-A18）、A97 ／ YN ／ CHN ／ 2015（YN-A97）、A113 ／ YN ／ CHN ／ 2015（YN-A113），均鉴定为CV-A6 血清型，D3a 基因亚型。4 株云南CV-A6 分离株的全基因序列已上传至GenBank 数据库，登录号为MW399171 ～MW399174。4 株云南CV-A6 分离株基因组全长 7 442 ～ 7 447 bp；5′UTR长 747 ～ 748 bp，包含 6 606 bp；3′UTR 长 83 ～ 97 bp，之间编码了1个包含2 201个氨基酸的多聚蛋白；4个病毒株的全基因组结构符合肠道病毒结构特征。与CV-A6 原型株相比，4个CV-A6 分离株在编码区无碱基的缺失或插入。

2.2 核苷酸及氨基酸同源性分析 用Geneious 软件对4 株CV-A6 分离株之间以及其与近几年国内CV-A6 流行株核苷酸和氨基酸序列同源性进行分析，结果显示，4 株CV-A6 分离株之间核苷酸和氨基酸序列一致性分别为94.8% ～97.9%和97.3% ～98.4%，与近几年国内流行株核苷酸和氨基酸序列一致性分别为94.6% ～97.9%和97.4% ～99.1%。

2.3 重组分析 分析4 株CV-A6 分离株各基因区域最同源的毒株，结果显示，YN-A100、YN-A18、YNA97、YN-A113 各基因区域与其他CV-A6 核苷酸一致性为 95.45% ～ 100%，YN-A113 在 3′UTR 与 CVA5 核苷酸一致性为97%，见表2。用Simplot 软件重组分析发现，4 株CV-A6 分离株无重组事件发生。

表2 4 株分离株全基因组与其他病毒株的相似性分析Tab.2 Homologies of complete genome of four isolates to other strains

2.4 系统进化分析 将54个 CV-A6 毒株和 4个CV-A6 分离株分为A ～D 4个基因型，其中B 基因型分为 B1 和 B2 亚型，C 基因型分为 C1 和 C2 亚型，D基因型分为 D1、D2、D3 亚型，D3 亚型又分为 D3a 和D3b。系统进化树分析显示，YN-A100、YN-A18、YNA97、YN-A113 株与我国近几年内地流行株一致，同属D3 亚型中的D3a 分支。其中YN-A100、YN-A18、YN-A97 株形成相对独立的分支，亲缘关系最近；YNA113 株形成另一相对独立分支。4个CV-A6 分离株与CV-A6 原型株Gdula 距离较远，原型株单独构成 A 基因型，与其他株，如 B 基因型 92022 ／ SD ／CHN ／ 1992 ／ ／ JQ364886、AFP051 ／ GD ／ CHN ／ 2007 ／KP143078 以及 C 基因型 96188 ／ SD ／ CHN ／ 1996 ／JQ364887、N ／ 313 ／ IND ／ 2008 ／ JN203517 等距离相对较远，分属不同的进化分支。见图1。

图1 CV-A6 毒株VP1 基因的种系进化树Fig.1 Phylogenetic tree of CV-A6 strains based on VP1 gene

2.5 毒力位点分析 4 株CV-A6 分离株的全基因组序列比对分析结果显示，4 株分离株在5′UTR 区的4个相关位点的核苷酸相同。在2A 区的第2 位，YNA100、YN-A18、YN-A97 的氨基酸为 R，YN-A113 的氨基酸突变为K。在2C 区的2个位点，4 株分离株氨基酸相同。在3A 区的第 68 位，YN-A100、YNA18、YN-A97 的氨基酸为 V，YN-A113 的氨基酸突变为 I；在 3D 区的第 67 位，YN-A100、YN-A18、YNA97 的氨基酸为 L，YN-A113 的氨基酸突变为 I；在3′UTR 区的第 27 位，YN-A100、YN-A18、YN-A97 的氨基酸为G，YN-A113 的氨基酸突变为C。见表3。

表3 4 株CV-A6 分离株核苷酸和氨基酸变异位点Tab.3 Nucleotide and amino acid variation sites of four CV-A6 isolates

3 讨 论

HFMD 于1957年首次在新西兰报道，为一种常见传染病，严重威胁全球婴幼儿健康，已成为严重的公共卫生问题［7-8］。大多数HFMD 感染是自限性的［7］，感染前期患者多无临床症状，随病情加重可导致发热出疹或非特异性中枢神经系统疾病，如急性驰缓性脊髓炎、心肌炎、无菌性脑炎等［9］。近年来在芬兰、中国等国家和地区的研究表明，CV-A6 感染患者表现出不同于其他肠道病毒基因型感染的临床症状，如脱甲症和大面积皮肤溃烂等，脱甲症致病机制尚不清楚，在一定程度上提示可能与CV-A6 毒力增强有关［10］。因此，长期监测CV-A6 相关的流行病学调查和病毒遗传进化，对疾病的预防控制和疫苗研究具有重要意义。

目前，多数研究将CV-A6 分为A ～D 4个基因型［6，11-12］，少数研究将 CV-A6 分为 A ～ E 5个基因型、A ～ F 6个基因型或 A ～ G 8个基因型［7-8，13］。本研究参考 SONG 等［6］对 CV-A6 的分型标准，基于CV-A6 完整VP1 核苷酸序列（915 bp）对分离到的4株CV-A6 进行种系进化分析，结果显示，4 株分离株同属D3 亚型中的D3a 分支。国际上对CV-A6 的分型也缺乏固定的分型标准，从而造成不同研究基因型的划分不同，但仍需积累大量不同地区的CV-A6序列信息，才能掌握CV-A6 毒株的起源及变异趋势，为CV-A6 的防控提供基础数据［14］。

本研究同时也发现，4 株CV-A6 分离株与中国大陆各地区CV-A6 亲缘关系最近，与中国周边地区日本等的毒株亲缘关系次之，与来自美国的原型株亲缘关系最远，表现了一定地域聚集性，这与王海滨等［14］的研究结果一致。寸建萍等［15］的研究中也认为云南分离株具有基因多样性特点，在不同地区可能会进一步发现不同的基因型或进化分支。通过全基因组分析表明，2015年云南分离株之间基因序列存在差异，提示相同地域或时间分离的毒株已经发生一定进化，但经重组分析，4 株CV-A6 分离株未发现重组事件。本研究的4 株CV-A6 分离株同属于D3 亚型，与我国近几年的CV-A6 内地流行株一致。SONG 等［6］和刘红波等［5］的研究认为，大部分来自日本、法国、芬兰、西班牙、美国、中国等国际分离株主要聚集在D3 亚型，且D3 亚型毒株具有更强的传播能力、感染力或毒力，可能与全世界CV-A6 大规模暴发有关。因此，加强CV-A6 毒株的分子流行病学研究具有重要意义。

本研究中4 株CV-A6 分离株基因组序列比对发现，5′UTR 区的4个相关毒力位点位于2个功能区1 型内部核糖体进入位点（IRES）（第306、502位）和高可变区（第 650、707 位），4 株分离株在这4个为位点的核苷酸相同，均为 C，CHEN 等［2］报道的突变为U。2A 区的功能主要是执行病毒多蛋白的翻译及翻译后蛋白的水解，从而促进新病毒颗粒的产生［2］。本研究 2A 区第 2 位氨基酸 YN-A113 在该位点的氨基酸为 K，其余 3 株为 R，CHEN 等［2］报道的在2A 区第2 位氨基酸为R，出现在重症的概率高于K，但本文未得出相同结论，本研究中4 株样本均来自轻症患者样本。2C 区的蛋白具有ATP 依赖性解旋酶和 ATP 依赖性 RNA 活性［2］。本研究 2C 区第41 位 YN-A113 氨基酸为 K，其余 3 株为 R，CHEN等［2］的研究中，R 在重症中出现的概率较高，但EV71 在 2C 区未见毒力相关位点的报道［16］。3A 区位点的主要作用是含酰基辅酶A 与ABCD3 相互作用，将PI4KB 募集至基因组复制点上［16］。本研究中4 株分离株氨基酸在3A 区均为A，该位点也未见与毒力相关的报道。3D 区的主要功能是作为RNA 依赖性RNA 聚合酶在改变毒力中发挥重要作用［16-17］。本研究YN-A113 第67 位氨基酸为I，其余3 株为L，CHEN 等［2］研究中重症出现该位点为 I 的概率高于 L，HUANG 等［18］的研究认为，EV71 的 3D 区第251 位是一个重要的与毒力和温度敏感相关的位点。3′UTR 区的功能主要为参与RNA 合成及病毒翻译［18］。本研究 3′UTR 区 YN-A113 第 27 位氨基酸为C，但EV71 在3′UTR 区未见与毒力相关位点的报道。因此，在这些毒力相关的位点中，YN-A113株的2A 和3D 区的突变考虑可能与毒力相关，不过尚需采用反向遗传学等方法进行进一步的验证，各突变位点可能存在协同作用才能与毒力相关，也需进一步研究。

综上所述，本研究对云南CV-A6 分离株进行了全基因组特征分析，有助于病毒基因型和亚型的数据更新，也为进一步研究CV-A6 的结构及功能，特别是对非编码区和编码区、结构蛋白和非结构蛋白、参与病毒感染、复制和免疫调节的关键位点以及病毒致病因子与人体免疫系统的相互作用的研究提供参考，进而为疫苗和治疗药物的研制提供更好的策略。