磁性分子印迹技术在药物分析学创新实验中的应用*

陈振羽，郭亚甜，张仪恒，张宇欣，张育珍，2，秦 蓓，2，张 博，2

(1 西安医学院药学院，陕西 西安 710021；2 西安医学院药物研究所，陕西 西安 710021)

左氧氟沙星(Levofloxacin，Lev)是一种喹诺酮类抗菌素，具有抑菌范围广，抗菌活性强的优点，在呼吸道、胃肠道、泌尿生殖系统、皮肤软组织等感染方面有良好疗效[1-2]。随着我国畜牧业的发展，该药品被广泛的应用在动物饲养中，用以预防和治疗相关感染，然而该药物通过代谢传递，会残留于各种奶制品中，由于婴幼儿常年食用配方奶粉，导致左氧氟沙星转入小孩体内，产生恶心、腹泻、头晕失眠、皮肤过敏、尤其是骨骼发育等诸多不良反应，对婴幼儿健康造成不可忽视的潜在威胁，但是，传统的检测技术如荧光光谱法、色谱分析法，紫外光谱法等还存在样品前处理繁琐、灵敏度低、选择性差等原因，迫切建立一种简便而且能够高效识别检测婴幼儿配方奶粉中左氧氟沙星的定量方法[3-5]。

磁性表面分子印迹技术(Magnetic Surface Molecularly Imprinted Technique，MSMIT)，是以固相基质为载体并在其表面进行聚合反应，以生命科学理论中酶与底物间的“锁-钥原理”为模型，合成与模板分子在空间结构和功能基团排布上高度吻合的三维空穴，并赋予磁性分离响应而建立起的一种特异性分离检测技术。该方法克服了传统分子印迹聚合物对模板分子包埋过深、传质速率慢、分离效率低等缺点，通过三维空穴的“记忆效应”，可以很好的识别复杂体系中的模板分子，通过外加磁场快速分离，高效地开展对复杂体系中目标分子的分离检测工作，具有选择性高、稳定性强、干扰小、重复性好等诸多优点[6-7]。

本次研究型创新综合实验规划：(1)查阅文献，了解磁性表面分子印迹技术的选择性吸附机理；(2)拓展知识，了解国内外动态，论述本项目意义；(3)设计并讨论实验方案；(4)开展材料合成、表征以及吸附分离工作；(5)Origin作图以及数据分析[8-11]。

本次研究型创新综合实验内容：采用热溶剂法制备Fe3O4纳米磁球[12-14]，包裹硅胶并引入双键，以此为载体材料，左氧氟沙星为模板分子，衣康酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，2，2-偶氮二异丁腈为引发剂，制备对左氧氟沙星具有特异性吸附的磁性表面分子印迹聚合物，利用该磁性聚合物对奶粉样品中左氧氟沙星进行分离富集，开发一种新的磁性印迹分离材料。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

SQP电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；T09-1S恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器，郑州长城科工贸有限公司；CMD-20X智能型电热恒温鼓风干燥箱，上海琅玕实验设备有限公司；SB—5200 DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；DZF-6020真空干燥箱，上海琅玕实验设备有限公司；TS-211B气浴摇床，上海岛析实业有限公司；TENSOR27傅里叶变换红外光谱仪，北京布鲁克科技有限公司；Agilent1260 Infinity高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；SHZ-D循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司。

左氧氟沙星(Levofloxacin，简写Lev，99%)，武汉拉那白医药化工有限公司；三氯化铁 天津市盛奥化学试剂有限公司；无水乙酸钠、柠檬酸三钠、α-甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、丙烯酰胺(AM)，天津市科密欧化学试剂有限公司；2，2-偶氮二异丁腈(AIBN，98%)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，99%)、3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS，97%)、衣康酸(IA，99%)、甲基丙烯酰胺(98%)、4-乙烯基吡啶(4-VP，96%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、戊二醛(GA)、N，N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)、乙腈、冰乙酸、正硅酸乙酯(TEOS)，天津市河东区红岩试剂厂；实验用水为去离子水。

1.2 磁性表面分子印迹聚合物的制备

1.2.1 Fe3O4的制备

称量1.35 g FeCl3·6H2O于平底烧瓶中，加入40 mL乙二醇，磁力搅拌使之溶解变为橙黄色液体；然后加入3.1 g无水乙酸钠，继续搅拌至深黄色；再称取0.4 g柠檬酸三钠于平底烧瓶中，搅拌30 min；将溶液转入聚四氟乙烯水热反应釜中，在烘箱中200 ℃下反应8 h。待反应结束后，取出反应釜并冷却至室温，弃去上清液，将制成的黑色沉淀转移到烧杯里，用去离子水和甲醇交替洗涤三次，磁性分离，在50 ℃真空减压干燥4 h以上即得Fe3O4纳米磁球。

1.2.2 Fe3O4@SiO2的制备

称取上述Fe3O4纳米磁球400 mg分散于160 mL无水乙醇和40 mL去离子水的混合溶液中，超声30 min，直至观察不到聚集现象，然后加入4 mL NH3·H2O使溶液呈碱性，再缓慢逐滴滴加3 mL TEOS，继续超声聚合反应1 h，中途摇晃瓶身防止底部聚沉。将得到的产物进行磁性分离，用去离子水和甲醇交替洗涤三次，在50 ℃真空减压干燥4 h以上即得Fe3O4@SiO2纳米磁球。

1.2.3 Fe3O4@SiO2@MPS的制备

称量200 mg的Fe3O4@SiO2纳米磁球于储液瓶中，加入80 mL乙醇和80 mL水并超声30 min，再加入0.5 mL的MPS继续超声并缓慢滴加2.0 mL氨水，置于摇床中，在60 ℃、150 rpm下振荡反应7 h。待反应结束后，进行磁性分离，将制得的磁性纳米粒子用去离子水和甲醇交替洗涤三次，在50 ℃真空减压干燥4 h以上即得Fe3O4@SiO2@MPS纳米磁球。

1.2.4 Lev-MMIPs与MNIPs的制备

称取0.1 mmol的左氧氟沙星于平底烧瓶中，加入50 mL的甲醇使其溶解，然后加入0.4 mmol衣康酸，室温下预聚合2 h；随后加入50 mg用甲醇超声分散均匀的Fe3O4@SiO2@MPS纳米磁球，放入摇床中，在30 ℃、150 rpm振荡组装1 h；再加入1 mmol交联剂EGDMA和20 mg引发剂AIBN，在N2保护下于摇床中60 ℃、150 rpm聚合反应20 h。反应结束后，将合成的印迹材料进行磁性分离，用甲醇和去离子水交替洗涤三次，在50 ℃真空减压干燥1 h。然后用200 mL甲醇：冰乙酸(8:2，V/V)溶液索氏提取洗脱24 h洗脱除去模板分子。最后，用甲醇合成材料洗至无酸味，60 ℃下真空减压干燥即得磁性表面分子印迹聚合物，简写Lev-MMIPs。

在不加入模板分子的情况下，重复以上实验步骤制备对照聚合物MNIPs。

1.3 奶制样品的前处理及应用

称取2 g婴幼儿配方奶粉于20 mL温水中超声溶解，精确吸取5 mL溶液于25 mL容量瓶中，再加入一定体积的左氧氟沙星储备液，用甲醇定容到刻度线，混匀后倒入离心管，涡旋混匀30 s，于8000 rpm离心15 min，取上清液即得处理好的奶制样品。

1.4 高效液相色谱(HPLC)分析

色谱条件：Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪； Agilent HC-C18(4.6×150 mm，5 μm)色谱柱；流动相：水相为0.1%甲酸水溶液(A)，有机相为10%乙腈甲醇溶液(B)，梯度洗脱 (0～2.00 min，A:B=80%:20%；2.01～4.00 min，A:B=70%:30%；4.00～10.00 min，A:B=50%:50%；10.01～12.00 min，A:B=80%:20%)；流速0.8 mL/min；检测波长294 nm；柱温为30 ℃；进样量5 μL。

移取3 mL加标样品于5 mL离心管中，加入10 mg磁性印迹材料，震荡吸附1 h，然后磁性分离，用1 mL洗脱液(10%冰乙酸甲醇溶液)洗脱30 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱仪分析。

2 结果与讨论

2.1 磁性印迹聚合物的制备

2.1.1 功能单体的考察

Lev-MMIPs的吸附能力依赖于许多不同的因素，其中功能单体通过氢键与模板分子作用，在立体空间中，不同功能单体与模板分子作用强弱不同，表现出吸附容量的差异，同时由于三维结构的构型，也表现出选择性的大小，两者共同影响印迹材料对模板分子的选择性和吸附容量，是合成材料的关键因素。在考察功能单体的过程中，加入左氧氟沙星0.1 mmol，交联剂1 mmol，引发剂20 mg，选择丙烯酰胺(AM)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸(MAA)、衣康酸(IA)、甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMA)、N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAM)共7种功能单体制备相应的磁性印迹聚合物，以吸附容量Q作为指标，评价Lev-MMIPs对Lev的特异性吸附能力，见表1所示。

表1 功能单体的考察Table 1 Investigation of functional monomers

实验结果显示，在相同其它实验条件下，衣康酸作为功能单体吸附容量最大，可以说明当衣康酸作为功能单体时，对左氧氟沙星的选择性吸附最好，所以本文选择其作为制备磁性表面分子印迹聚合物的最佳功能单体。

2.1.2 致孔剂的考察

反应溶剂也称为致孔剂，在反应体系中，溶解模板分子、功能单体、交联剂等，同时分散Fe3O4@SiO2@MPS纳米磁球，合适的致孔剂可以很好的促进表面聚合反应，有利于三维空穴的形成，影响Lev-MMIPs的吸附容量，所以研究中选择7种溶剂:甲醇、甲醇:水(1:1，V/V)、乙腈、乙腈:水(1:1，V/V)、DMF、DMF:水(1:1，V/V)、甲醇:乙腈(1:1，V/V)制备Lev-MMIPs磁性印迹材料，以吸附容量Q作为指标，评价Lev-MMIPs对Lev的吸附效果，见表2所示。

表2 致孔剂的考察Table 2 Investigation of pore forming agent

实验结果表明，在相同其它条件下，以甲醇作为致孔剂制备的Lev-MMIPs对Lev具有最优的吸附容量。因此本文选择甲醇作为合适的致孔剂。

2.1.3 交联剂的考察

交联剂在印迹聚合物膜的形成过程中有着支撑骨架效应，交联剂过多使得聚合反应速率过快，导致材料成絮状，过于蓬松，使得聚合物严重团聚，同时磁性消失；交联剂过少使得聚合反应不完全，印迹聚合物膜不易形成，同时形成空穴过少，吸附容量过低，因此交联剂在磁性表面分子印迹聚合物的合成过程中起着关键作用。在本研究中，固定模板分子和功能单体的用量，分别加入乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、N，N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)、戊二醛(GA)3种交联剂各1 mmol制备相应的磁性印迹聚合物，以吸附容量Q作为指标，评价Lev-MMIPs对Lev的吸附性能，实验结果表明，当模板分子:功能单体:交联剂=1:4:10时，选择性吸附最好，所以后续采用该优化比例制备吸附材料用于实验研究，见表3所示。

表3 交联剂的考察Table 3 Investigation of crosslinking agent

2.2 磁性印迹聚合物的表征

2.2.1 TEM表征分析

通过表面聚合反应，在最优比例条件下制备出磁性表面分子印迹聚合物，该材料呈球形，单分散性良好，具有清晰的核-壳结构，内部黑色部分为磁性Fe3O4核，约160 nm，外部为聚合物层，整体粒径约200 nm，印迹层位于外表面，吸附过程中传质速率快，可有效减少“包埋”现象，提高选择性吸附容量，见图1所示。

图1 Lev-MMIPs透射电镜图Fig.1 The TEM image of Lev-MMIPs

2.2.2 红外光谱分析

对Fe3O4、Fe3O4@SiO2、MMIPs进行红外光谱表征。由裸磁球Fe3O4的红外光谱曲线(图2a)可以看出，586 cm-1附近出现的特征峰归属于Fe-O的伸缩振动，说明Fe3O4制备成功；在Fe3O4@SiO2的吸收曲线(图2b)中出现1110 cm-1的特征峰，是典型的Si-O-Si伸缩振动吸收峰，结合TEM图可以证明二氧化硅层很好的包裹于Fe3O4的外侧；在印迹材料的红外光谱曲线(图2c)中，可以看到1730 cm-1出现很明显的特征吸收峰，该峰归属于交联剂和功能单体中的C=O，而1400 cm-1附近的特征峰则是印迹层中大量C-O伸缩振动所致，3131 cm-1处的宽吸收峰，则归属于衣康酸羧基中的-OH。三者光谱图分析对比可以看出，通过聚合反应，成功地合成了磁性表面分子印迹聚合物，见图2所示。

图2 红外光谱图Fig.2 FT-IR spectra

2.3 磁性印迹聚合物对左氧氟沙星的分离富集

为了验证合成印迹材料对实际样品中左氧氟沙星的选择性吸附效果，研究中分别配制婴幼儿配方奶粉空白溶液、以及加标模拟样品溶液，采用1.4方法分离富集并进行色谱分析，见图3实验结果显示，图3a为空白样品图，其中杂质多而且基线噪音大；图3b为加标样品，出现了左氧氟沙星色谱峰，空白处几乎无干扰；图3c为采用合成的磁性印迹材料吸附，然后洗脱富集所得结果。由此可以看出，背景噪音降低、样本杂质基本都被剔除，左氧氟沙星信号明显提高，可以说明合成的磁性表面分子印迹聚合物对奶粉样品中的左氧氟沙星有很好地分离富集效果。

图3 高效液相色谱图Fig.3 Chromatograms of HPLC

2.4 研究型综合实验运行模式探讨

2.4.1 文献查阅与批阅

药学本科生中大学生创新创业项目的开展，对在校大学生培育创新创业项目有很好地支撑效果，也对大学生日后的科学研究兴趣和研究思维具有很好地启蒙作用，同时也反哺理论教学，使学生对本专业知识以及学科前沿有更高层次理解，激发学生兴趣，调动学生创新创业潜能。为了使学生很好地认识项目，结合本科生时间有限的特点，建立QQ讨论群，安排每名学生每周查阅文献两篇，研读并做好读书笔记，然后上传QQ群，项目组学生共享，指导老师对每篇文献进行批阅，用来指导学生，掌握学生看文献的领域是否正确，内容是否相关，有没有可借鉴之处，创新点是什么等帮助学生、扶持学生走向正轨。

2.4.2 运用PBL教学法指导开展实验

以问题为导向的教学方法(problem-based learning，PBL)，是基于现实世界的以学生为中心的教育方式[15-16]。该方法通常被用于教学的过程中，而在本项目的执行过程中，我们采用该方法，收集实验环节中的各种问题，然后集中讨论，达成共识，再去落实实验研究，很好地推动了学生实验研究的开展。本项目研究过程中，共有合成、表征、分离富集三个方面，共收集10问题加以讨论，比如：“功能单体有哪些”、“ 吸附的作用力是什么”、“表征材料的方法有哪些”、“氮气保护的操作如何实现”等，很好的从操作和理论两方面给学生充分的指导，保证学生顺利完成项目内容。

2.4.3 作图、数据处理和结果分析

作图、数据处理以及每一步结果分析，对学生和后续实验都很重要。在大创项目落实的过程中，我们对Origin、ChemDraw、3DMax、Excel等软件进行了集中培训，提供一些数据学生练习，老师指导，手把手教会学生如何作图、制表、处理数据等。在项目期间，要求学生一边做实验，一边通过作图形象地表达研究内容，及时进行数据分析实验结果，这样不仅仅很好地完成了实验内容，而且提高了学生绘图、分析数据的能力，很好地完成了项目内容。

3 结 论

磁性表面分子印迹聚合物在样品分离富集过程中特异性强，检测浓度低，能有效地改善样品中痕量分析的诸多不足。本文以双键修饰后的Fe3O4@SiO2作为支撑材料，左氧氟沙星为模板分子，衣康酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，2，2-偶氮二异丁腈为引发剂，甲醇为致孔剂合成制备了Lev-MMIPs磁分子印迹材料，并对婴幼儿配方奶粉中加标左氧氟沙星开展了分离富集效果验证。通过研究型创新综合实验的开展，促进学生掌握磁性印记聚合物的制备、原理、表征、吸附性能研究等，培养学生查阅文献解决问题、规范仪器操作、培育创新思维、开拓研究领域眼界等，提高学生绘图、制表、分析数据等水平，提高药学本科生的科研综合能力，落实大学生创新创业项目开展。