不同干燥条件及部位对抱茎小苦荬总黄酮的影响*

赵梦琪，王科栋，李克杰，石路德

(1 山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2 山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355；3 济南市商河县中医院，山东 济南 251600)

抱茎小苦荬(IxerissonchifoliaBge.Hance)为小苦荬属植物，全草可入药，具有清热解毒，凉血活血之功效，可用于治疗无名肿痛、乳痈疖肿、阑尾炎、肝炎等各种炎症以及肺热咳嗽、肺结核等[1]。抱茎苦荬菜化学成分研究显示其含有黄酮类、木质素类、皂苷类、酚酸类及挥发油类成分[2-5]，其化学成分以黄酮类物质含量最高[6]，已报道从抱茎小苦荬中分离得到130个化学成分，包括黄酮类、倍半萜类、三萜类、苯丙素类、有机酸类等。它们表现出多种药理活性，如保护心脑血管系统、抗癌作用和抗病毒等[7]。因此，本文对其不同干燥温度下不同生长部位总黄酮进行含量测定研究，以期为抱茎小苦荬临床用药提供一定的干燥加工数据参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

METASH(X-5)型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；KQ-500GVDV型双频恒温数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHK-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州科泰实验设备有限公司；精密电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；QE-300型高速粉碎机，浙江屹立工贸有限公司；40目分样筛，浙江上虞市金鼎标准筛具厂，其他容量仪器均经矫正。

抱茎小苦荬药材，采于山东中医药大学，经山东中医药大学孙稚颖教授鉴定为抱茎小苦荬(IxerissonchifoliaBge.Hance)；芦丁标准品(HPLC≥98%)，上海源叶生物科技有限公司，所用试剂均为国产分析纯。

1.2 实验分组

根据植株部位分为去根植株组、净根组、全植株组三大组，根据干燥条件细分为晒干组、60 ℃烘干组、80 ℃烘干组，如表1所示：

表1 干燥条件与植株部位实验分组表Table 1 Experimental grouping table of drying conditions and plant parts

1.3 标准品溶液制备

精确称取芦丁标准品2.5 mg，加入5滴乙醇溶解，加入60%乙醇定容至25 mL，摇匀，得质量浓度为0.1 mg/mL的标准品。

1.4 供试品溶液制备

精密称取粉碎的抱茎小苦荬0.5 g，置于磨口三角瓶中，精密加入60%乙醇溶液40 mL，50 ℃、45 kHz、100%功率超声提取60 min，经抽滤得提取液，置于50 mL容量瓶用60%乙醇溶液定容备用。

1.5 总黄酮含量测定方法

精密量取供试品溶液2 mL，置于25 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠1 mL，摇匀，静置5 min，再加入10%硝酸铝 1 mL，摇匀，静置5 min，最后加入4%氢氧化钠4 mL，加入60%的乙醇稀释至刻度定容，摇匀，静置15 min。以相应试剂为空白，用紫外分光光度法测定。

1.6 DPPH自由基清除实验

DPPH自由基溶液配制：取一定量DPPH，用无水乙醇配制成质量浓度0.04 mg/mL的溶液(现用现配)；

样品溶液配制：分别取不同干燥方式下的去根样品、根样品和全株样品采用“1.3”方法用无水乙醇配制样品溶液；

按2 mL无水乙醇+2 mL DPPH自由基溶液；2 mL样品溶液+2 mL DPPH自由基溶液；2 mL样品溶液+2 mL无水乙醇溶液加入反应液，摇匀后于室温避光静止30 min，转移至比色皿内以无水乙醇作空白分别在517 nm处[8]测吸光度。每组做3个平行实验，计算个样品对DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除计算公式一般为：

式中：As为样品溶液与DPPH自由基溶液组的吸光度；Ac为样品溶液与无水乙醇组的吸光度；Ab为无水乙醇与DPPH自由基溶液组的吸光度。

阳性对照的测定：称取0.01 g维生素C，蒸馏水定容至 50 mL容量瓶中，配成质量浓度0.20 mg/mL溶液。分别取 0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mL至10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。按样品溶液的测定方法进行测定[9]。

2 结果与分析

2.1 不同干燥条件下药材介绍

晒干条件：色泽最暗，呈现褐绿色，气味最淡，如图1A所示。

80 ℃烘干条件：色泽黯淡，呈现灰绿色，气味最浓，如图1B所示。

60 ℃烘干条件：色泽较黯淡，呈现暗绿色，气味较淡，如图1C所示。

图1 不同干燥条件下抱茎小苦荬样本Fig.1 Samples of Ixeris sonchifolia under different drying conditions

2.2 测定波长的选择

精密吸取2 mL供试品溶液于25 mL容量瓶中，加10%硝酸铝1 mL，摇匀，静置5 min，加4%氢氧化钠4 mL，加入60%的乙醇稀释至刻度定容，摇匀，静置15 min，制备成样品溶液，置于具塞试管中，以相应试剂为空白，于紫外分光光度计上在190～800 nm内进行扫描，结果样品显色液在510 nm处有最大吸收峰，因此选择510 nm作为抱茎小苦荬总黄酮测定的最佳吸收波长。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、 2.0 mL、2.5 mL和3.0 mL置于25 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠1 mL，摇匀，静置5 min，加10%硝酸铝1 mL，摇匀，静置5 min，加4%氢氧化钠4 mL，加入60%的乙醇稀释至刻度定容，摇匀，静置15 min，以试剂为空白，于510 nm处测定吸光度，以芦丁对照品溶液浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，并以吸光度对浓度进行线性回归，得回归方程为Y=12.811X-0.2595，γ=0.9998，表明：芦丁对照品溶液在0.02352～0.04704 mg/mL浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系，如图2、表3所示。

表2 总黄酮测定的标准曲线数据Table 2 Standard curve data for determination of total flavonoids

图2 总黄酮测定的标准曲线Fig.2 Standard curve for determination of total flavonoids

2.4 精密度试验

精密量取QZ-S组供试品溶液2.0 mL，按照“1.4”所述方法进行显色，并测定溶液吸光度值，连续测定6次，得RSD值。结果得RSD值为0.03%，表明仪器精密性良好，如表3所示。

表3 精密度实验结果Table 3 Precision test results

2.5 重复性试验

精密量取QZ-80组供试品溶液1.0 mL，按照“1.4”所述方法进行显色，并测定溶液吸光度值，平行测定5份，得RSD值。结果得RSD值为2.40%，表明此实验方法可靠，如表4所示。

表4 重复性试验结果Table 4 Repeatability test results

2.6 稳定性试验

精密量取QZ-60组供试品溶液2.0 mL，按照“1.4”所述方法进行显色，分别在0、5、10、15、20、25、30、40、50、60 min 测定溶液的吸光度值。结果得RSD值为2.02%，表明样品溶液稳定，如表5所示。

表5 不同时间测定样品中总黄酮的吸光度值Table 5 Determination of absorbance value of total flavonoids in samples at different time points

2.7 回收率试验

精密称定QG-80组抱茎小苦荬粉末0.5 g共5份，配制成供试品溶液，各取2 mL放于5个25 mL容量瓶中，分别加入“1.2”项下制备所得芦丁标准品1.0 mL(芦丁含量为0.1 mg)，加入60%乙醇定容至刻度，精密量取2.5 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，按“1.4”所述方法进行显色，并测定吸光度值，计算加样回收率。结果得均回收率为87.39%，回收率较好，如表6所示。

表6 回收率测定结果Table 1 Determination results of recovery rate

2.8 测定方法

取抱茎小苦荬粉末粉末适量，精密称定，按设定的条件进行超声提取后，滤过，置于50 mL容量瓶定容，精密量取续滤液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠1 mL，摇匀，静置5 min，加10%硝酸铝1 mL，摇匀，静置5 min，加4%氢氧化钠4 mL，加入60%的乙醇稀释至刻度定容，摇匀，静置15 min，于510 nm处测定吸光度，用回归方程计算总黄酮的含量。

2.9 实验数据

表7 抱茎小苦荬不同干燥条件不同部位总黄酮含量及DPPH清除率Table 7 Total flavonoids content and DPPH scavenging rate in different parts of Ixeris sonchifolia under different drying conditions

2.10 相关性分析

现代研究表明抗氧化活性与植物体中多酚和总黄酮含量有密切的关系[10]。因此对抱茎小苦荬不同部位总黄酮含量与DPPH清除率进行相关性分析，DPPH体系与总黄酮含量相关系数R为0.916，说明总黄酮是DPPH自由基清除能力的影响因素。

表8 总黄酮含量与DPPH抗氧化方法间的相关性Table 8 Correlation between total flavonoids content and DPPH antioxidant method

3 结 论

抱茎小苦荬有三萜、甾醇、倍半萜、黄酮、香豆素等多种化学成分[11]，其总黄酮含量是评价药品质量的重要指标之一。抱茎小苦荬已经被开发为多种临床试剂，由抱茎苦荬菜为原料提取精制而成的静脉注射制剂苦碟子注射液，主要成分为腺苷及黄酮类物质[12]，能够有效增加心脑血流量，预防缺血损伤，扩装冠状动脉血流量，提高心肌的供血和供氧能力[13]，本文对抱茎小苦荬不同干燥条件下不同生长部位的总黄酮含量以及抗氧化活性进行测定研究后发现：抱茎小苦荬总黄酮含量大小的顺序为：去根>全草>根，DPPH自由基清除率大小依次为：去根>全草>根。多项研究表明，黄酮中酚羟基结构中的邻位酚羟基很容易被氧化成醌类结构，对活性氧等自由基具有很强的捕捉能力[14]，通过相关性研究发现，各部位提取液抗氧化活性与总黄酮含量之间有明显的相关性，说明总黄酮为抱茎小苦荬提取液清除自由基作用的主要影响因素。经数据分析，抱茎小苦荬在晒干干燥条件下总黄酮含量更高，抱茎小苦荬的去根部分总黄酮含量所占比例更高，为其资源的开发利用提供参考依据。