Box-Behnken响应面法优化玫瑰茄花色苷浸提工艺*

谢秋情，范哲贤，柯晓燕

(三明医学科技职业学院，福建 三明 365000)

玫瑰茄(HibisunsSabdriffaL.)又名苏丹红、洛神花、山茄等，是锦葵科木槿属一年生草本植物，原产于非洲苏丹，现广泛分布于全球热带和亚热带地区，在福建、广东、广西和云南南部等地引入栽培，已形成规模化种植[1]。玫瑰茄含有类黄酮素、原儿茶酸、花青素、异黄酮素以及丰富的氨基酸、维生素、糖类、有机酸、无机盐等化学成分，其中玫瑰茄花萼中花色苷含量高达2%[2-4]。《傣医药》记载：“花萼，酸，凉。清热解渴，敛肺止咳。用于高血压症，咳嗽，中暑，酒醉”[5]。现代研究表明，玫瑰茄花萼具有抗氧化、抗菌、降血脂、降血糖、降血压、抗肿瘤等药理作用[6-10]。赵晓峰等[11-13]研究表明，花色苷易受自身化学结构、酸度、温度、浓度、氧气等内外因素的影响，高度不稳定，容易降解。为了提高花色苷得率，且保持花色苷原有的结构特点，本实验采用传统浸提方法，利用Box-Behnken响应面法研究玫瑰茄花色苷浸提工艺，为进一步发掘和研究玫瑰茄产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玫瑰茄干花萼：福建三明；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(纯度98.7%) 四川省维克奇生物科技有限公司；无水乙醇、三水合乙酸钠、氢氧化钠、氯化钾、浓盐酸均为分析纯，西陇科学股份有限公司；pH 4.5 缓冲液：CH3COONa(1 mol/L):HCl (1 mol/L):水=100:60:90 (V/V)；pH 1.0 缓冲液：盐酸溶液(0.2 mol/L):KCl溶液(0.2 mol/L)=25:67(V/V)。

1.2 仪器与设备

BHS-2数显恒温水浴锅，江阴市保利科研器械有限公司；JD200-4电子天平(万分之一)，沈阳市多杰电子科技有限公司；雷磁PHS-25 pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；RE-52旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-Ⅲ循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；UV-3200紫外分光光度计，上海美普达仪器有限公司。

开采技术的创新促进了油气田高效开发。创新页岩气勘探开发工程技术，大幅降低了单井综合成本，创新形成了页岩气地质综合分析与产能概率性评价技术；积极探索“一趟钻”钻井新技术，优质储层钻遇率提高至90%以上，钻井周期缩短50%以上；形成了长水平井分段分簇体积压裂改造技术及“工厂化”作业模式，工程作业效率提高30%，建井成本降低近30%。南海高温高压钻完井关键技术取得重大突破，钻井成功率达到100%，平均钻井周期由175天降至52天，使我国跻身于世界海上高温高压钻完井技术先进行列。

1.3 方 法

1.3.1 玫瑰茄花色苷的浸提工艺

在分析玫瑰茄花色苷浸提的单因素试验结果基础上，应用Design Expert8.02软件进行Box-Bennhken响应面设计，分析酸性乙醇浓度、浸提温度、料液比对玫瑰茄花色苷含量的影响，响应面试验结果见表2所示，方差分析见表3所示。

1.3.4 玫瑰茄花色苷浸提Box-Benhnken响应面优化试验

1.3.2 玫瑰茄花色苷波长的测定

在单因素试验基础上，以总花色苷含量为响应值，选取对玫瑰茄花色苷含量影响较大的因素酸性乙醇浓度(A)、浸提温度(B)和料液比(C)3个因素为自变量，利用Design-Expert 8.05软件设计三因素三水平响应面(Box-Benhnken)优化试验，对玫瑰茄花色苷的浸提参数进行优化，具体因素水平编码表见表1所示。

1.3.3 玫瑰茄花色苷含量的测定

式中：ΔA=(A520 pH1.0-A700 pH1.0)-(A520pH4.5-A700 pH4.5)；V 为浸提液总体积，mL；D为稀释倍数；M 为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的相对分子质量，484.84 g/mol；ε 为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔吸光系数，29600 L/(mol·cm)；m为样品质量，g；L为比色皿宽度，1 cm。

根据唐琳等[14-15]的研究方法，采用pH示差法测定玫瑰茄花色苷含量。将玫瑰茄花萼浸提液定容至100 mL量瓶，分别取1.0 mL，用氯化钾缓冲液(pH 1.0)和醋酸钠缓冲液(pH 4.5)定容至25 mL的棕色容量瓶中，静置60 min，以缓冲溶液作空白，分别测定溶液在520 nm和700 nm 处的吸光度(A)，按照下列公式计算玫瑰茄总花色苷的含量：

总花色苷含量(mg/g)=ΔA×V×D×M/(ε×m×L)

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在现阶段教学中，将生活中的实际情况与数学知识相结合仍然存在阻碍，但是在以后的教学发展中，将课堂教学与实际生活相结合，将现实生活中的情境带入课堂；将课后练习逐步趋向为生活实践进行知识巩固，这些方式都会可以更好地引导学生把数学知识用于解决实际问题。为了新一代的发展，教师在培养学生学习数学兴趣的同时，也应注重发展学生的创造力和想象力，培养学生解决实际问题的能力，进而为国家培养新型人才打下良好的基础。

图1是根据试验台风室布置绘制的物理模型。风室的长度为5400 mm、宽度为800 mm，风室进口段长度730 mm、宽度400 mm、高度480 mm。本模拟所选锅炉主风室共有30个炉排调风门，取一半锅炉风室模型，因此本模拟的锅炉模型共有15个炉排调风门，分成5组。

HB滤波器由于其抽头系数一半为零,因此计算速率快,实时性强。但是由于常系数HB 的滤波器参数已定,无法根据不同通信系统配置不同的滤波器系数,因此需要设计如图9所示的可配置半并行 HB 结构。首先利用MATLAB中的FDATOOL工具将滤波器的抽头系数设计好,其次使用参数配置模块将5种模式的HB滤波器抽头系数保存在ROM中。然后设置HB 各参数输入接口,由上位机指令发送单元经过参数配置模块根据所选模式对滤波器参数进行配置,参数可灵活配置是本文实现多种通信系统正常工作的核心。

取玫瑰茄花萼浸提液和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品溶液稀释一定体积，在200～1000 nm范围进行波长扫描，绘制光谱图，确定出玫瑰茄花色苷的最佳测定波长。

表1 花色苷Box-Benhnken响应面因素编码水平表Table 1 Factors and levels in Box-Benhnken design of anthocyanin

2 结果与分析

2.1 玫瑰茄花色苷波长的确定

玫瑰茄花萼浸提液和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品溶液全波长扫描光谱图见图1所示。

实验选取宜昌地区高坝州水电站坝肩右岸边坡(A)、清江水布垭三友坪公路边坡(B)、三峡大学信息技术楼侧边坡(C)为研究坡地，研究样地描述如表1所示，三处均为岩质边坡，均采用植被混凝土生态防护施工工艺，边坡初始条件及后期管理养护条件等无较大差异。

图1 全波长扫描光谱图Fig.1 UV-visible spectrum

2.2 Box-Bennhken响应面法优化试验结果

称取玫瑰茄干花萼粗粉3 g，按一定的料液比加入适量溶剂，于恒温水浴锅中浸提一定时间。浸提液滤过，备用。

表2 Box-Bennhken响应面试验结果Table 2 Results of Box-Bennhken design

表3 Box-Benhnken响应面试验结果方差分析Table 3 ANOVA for Box-Benhnken design

续表3

由表3可以看出，影响花色苷含量的因素主次顺序为浸提温度(B)>酸性乙醇浓度(A)>料液比(C)。模型中A、B、A2、B2对总花色苷含量的影响极显著(P<0.01)，C2对花色苷含量的影响显著(P<0.05)。而C、AB、AC、BC均不显著(P>0.05)，表明不同提取条件对玫瑰茄花色苷含量的影响不同。

采用Design Expert 8.0.6软件，以花色苷含量为评价指标，对各因素进行二次多项式拟合，二次多项式拟合方程为：

R1=6.89+0.24A-0.33B+0.070C+0.18AB+2.5×10-3AC+

如图1所示，玫瑰茄花萼浸提液和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品溶液在紫外-可见光区 200～1000 nm进行全波长扫描，确定玫瑰茄花色苷的最佳测定波长为520 nm。

0.17BC-0.52A2-0.68B2-0.28C2

其中：P=0.0003， R2=0.9624，失拟项P=0.1419。

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此模型的P值分别为0.0003，为极显著 (P<0.01)，R2=0.9624表明模型对本试验拟合程度良好，失拟项P值为0.1419，无显著性差异，方程能很好的响应，有统计学意义。

由图2可知，两两因素之间交互作用的响应面图都较为平缓，表明各因素之间的交互作用不显著。花色苷含量与浸提温度的曲线较酸性乙醇浓度与花色苷含量的曲线陡，说明浸提温度对玫瑰茄花色苷含量的影响较酸性乙醇浓度高，同理可知，酸性乙醇浓度的影响对玫瑰茄花色苷含量的影响大于料液比，与方差分析结果相符。

图2 各因素交互作用对玫瑰茄花色苷含量的响应面和等高线Fig.2 Response surfece diagram and Contour plots showing the interaction effect of anthocyanins on Hibiscus sabdariffa L.

由Design-Expert8.0.6分析得到优化后的浸提工艺参数为酸性乙醇浓度41.94%，浸提温度67.96 ℃，料液比1:15.32(g/mL)，花色苷的含量预测值为6.95 mg/g。考虑实际可操作性，调整参数，最佳浸提条件确定为酸性乙醇浓度42%(pH=2.0)，浸提温度68 ℃，料液比1:15(g/mL)，浸提1.5 h，浸提2次。此条件下进行3次平行验证实验，玫瑰茄花色苷提取量为(7.43±0.06)mg/g。与预测值相近，响应面法优化该浸提方法具有一定的实际应用价值。

3 结 论

本实验以福建三明产玫瑰茄为原料，在单因素实验基础上，应用Design Expert8.0.6进行Box-Bennhken响应面优化试验，得到最佳浸提工艺条件为酸性乙醇浓度42%(pH=2.0)，浸提温度68 ℃，料液比1:15(g/mL)，浸提1.5 h，浸提2次，玫瑰茄花色苷提取量为(7.43±0.06)mg/g，与模拟预测值接近，说明响应面法优化玫瑰茄花色苷的浸提工艺可靠。