特色农产品兰州百合产地溯源及确证

李善家 ，崔莉娟，苏培玺，王 辉，王福祥，王子濠

（1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050；2.中国科学院西北生态环境资源研究院，甘肃兰州 730000）

农产品产地溯源主要是检测其化学成分和生物组成，如红外光谱溯源技术和高效液相色谱溯源技术，然而用于产地溯源的化学成分受产品成熟度、加工方式、储藏条件影响造成损失，导致有效信息丢失，影响产地判别的准确性[1]；拉曼光谱溯源技术引用新物质对被测体造成某种程度的污染而导致一定的误差；DNA 指纹图谱和SSRs 标记技术因操作难度大、耗费成本高而限制其普及，且DNA 是物种的特有属性，不会因环境的变化而改变，在地理溯源中有限制[2]。基于同位素自然分馏效应的稳定同位素溯源技术，因机体内碳、氮、氧等同位素组成受气候、环境、代谢类型等因素影响，其丰度呈现显著的地域特征，是追溯农产品地理来源和确证的有力工具[3-4]。矿质元素技术因农产品矿质元素含量受土壤类型、水、气候、人类活动等影响存在差异性和独特性，其特征性矿质元素可以作为农产品重要的产地溯源指标[5]。

兰州百合（LiLum davidivarunicdor）是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生草本植物，属于“川百合”变种，以其食用性闻名，是国家地理标志农产品。栽培种植区域主要集中在兰州市七里河区、西固区、榆中县及周边临洮县等地。兰州百合色泽洁白如玉、肉质肥厚细腻、纤维少、味微甜；食疗具有止咳平喘、改善睡眠、预防老年痴呆等功效[6]；药用具有清热解毒、滋阴润肺、清心安神之功效，其鳞茎含有多糖、黄酮类、多酚类等生物活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫等功能[7-8]。市场上兰州百合具有较高的经济价值，有不法商家产地造假、以次充好，致使质量安全问题频发，对消费者权益造成一定的威胁。稳定同位素和矿质元素指纹技术联合已被应用于豆类[9]、水稻[10]、茶叶[11]等的产地溯源，对准确判别其原产地提供了技术支撑，但有关兰州市百合产地溯源的相关研究尚未见报道。利用稳定同位素和矿质元素指纹技术联合研究兰州百合的地域和来源差异，借助生态化学计量学与数理统计学的方法筛选产地溯源典型有效指标，建立和评价判别模型和数据库，实现百合溯源与确证，对地理标志产品兰州百合的品牌保护和产业发展具有重要意义和应用价值。

本研究针对兰州百合核心主产区的18 个供试样本，利用稳定同位素和矿质元素指纹技术联合开展兰州百合的溯源研究，同位素比率质谱（Isotope Ratio Mass Spectrometry，IRMS）测定δ13C、δ15N、δ18O 等3 种稳定同位素比率，电感耦合等离子体质谱（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）测定K、Mg、Ca、Na、B、Fe、Zn、Al、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd、Se、As、Pb 等16 种矿质元素含量；结合主成分分析（Principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法分析（Orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）和线性判别分析（Linear discriminant analysis，LDA），对不同产区兰州百合构建分类模型，验证判别溯源确证；以期为主产区兰州百合质量控制、产地溯源、食品安全等方面提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

兰州百合（LiLum davidi var unicdor）于2018年10 月收获季节采集于核心主产区兰州市七里河区黄峪镇、西果园镇、中铺镇和阿甘镇等，共收集18 个不同地理来源的样本，并使用手持全球定位系统记录每个采样点的经度、纬度和海拔，国家环境信息中心获取并计算得到年均气温、年降水量和相对湿度见表1。

表1 兰州百合主产区采样点环境信息Table 1 Environmental information of sampling sites in the main producing area of Lanzhou lily

253 Plus 型气体稳定同位素质谱仪、Delta Plus XP 型稳定同位素质谱计、Flash EA 型元素分析仪、Element XR 型电感耦合等离子体质谱仪 美国赛默飞世尔公司；微波消解仪器 美国CEM 公司；Millipore 超纯水系统 美国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 百合样品置于恒温烘干箱70 ℃烘干至恒重，植物粉碎机粉碎样品，经充分研磨后过100 目筛，收集备用。

1.2.2 稳定同位素δ13C 和δ15N 测定 称取5 mg 百合粉末装入锡囊。使用同位素比率质谱仪和元素分析仪（Flash EA）进行δ13C 和δ15N 的分析。样品经自动进样器进入元素分析仪（Flash EA），高温燃烧产生CO2和N2，在工作载气氦气的载带下流经吸附柱分离纯化后进入同位素比率质谱仪测定δ13C 和δ15N。分析条件：吹扫气流180 mL/min，氧化炉温度1020 ℃，还原炉温度680 ℃，载气流速90～100 mL/min。IAEA-600：δ13CV-PDB=-27.77‰±0.2‰，USGS24：δ13CV-PDB=-16.09 ‰±0.2 ‰ ；IAEA-N-2：δ15NAir=20.30‰±0.2‰，IAEA-NO-3：δ15NAir=4.70‰±0.2‰为标样对仪器进行校正。样品一式三份进行分析，并取其平均值。

1.2.3 稳定同位素δ18O 测定 称取1 mg 样品装入银囊，用同位素比率质谱仪和元素分析仪（Flash EA）对δ18O 进行分析。样品中氧元素在高温裂解炉中裂解释放后与玻璃碳瞬间反应生成CO，被高纯氦气携载经过色谱柱进入同位素比率质谱仪测定δ18O。分析条件：炉温1380 ℃，载气流速150 mL/min，吹扫气流200 mL/min，色谱柱温50 ℃。IAEA-601：δ18OV-SMOW=23.14‰±0.2‰和IAEA-CH-6：δ18OV-SMOW=36.40‰±0.2‰为标样对仪器进行校正。样品一式三份进行分析，并取其平均值。

1.2.4 矿质元素含量测定 称量0.10 g 百合样品放入聚四氟乙烯消解容器中，依次加入5 mL 60%硝酸和1 mL 30%过氧化氢进行消解。消化后的溶液在电热仪180 ℃条件下去除多余酸溶液至1 mL，超纯水定容至10 mL，即为待测元素供试溶液。由电感耦合等离子体质谱仪测定16 种矿质元素（K、Mg、Ca、Na、B、Fe、Zn、Al、Mn、Cu、Mo、Cr、As、Se、Cd、Pb）含量。分析条件：射频功率1550 W，雾化室温度2 ℃，采样深度10 mm，等离子体流量15 L/min，载气流量1.0 L/min，辅助器流量0.45 L/min，采集点数3 次，重复次数3 次。

1.3 数据处理

农产品产地溯源主要分析表征不同地域来源农产品的特异性指标。PCA、OPLS-DA 和LDA 等多元数理统计分析技术可以有效实现多个地域特征指标的综合分析，建立起能够区分农产品产地来源的特征指纹图谱。PCA 是对原有数据降维，揭示数据群的主要影响因子，并对具有代表性的主成分数据进行可视化的多元统计分析方法[12-13]。OPLS-DA 是一种适用于样本量小和自变量较少的有监督的判别方法，可以解决多变量共线性问题，排除干扰数据，提高模型的解释性和预测的可靠性[14]。R2和Q2用来评价OPLS-DA 模型的拟合程度和预测能力，R2和Q2均＞0.5 时，模型有较好的预测性[15]。变量投影重要度（Variable importance for the projection，VIP）是OPLS-DA 模型中评价变量重要性常用参数，VIP 值可以量化每个变量对分类的贡献，VIP 越大（VIP＞1），对地域判别的差异性越显著[16]。LDA 也是一种有监督的线性降维分析方法，其通过低维向量空间中最大化类间距离和最小化类内距离，保证不同类中的变量尽可能分离[17]。采用SPSS 20.0 统计分析软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和LDA 分析，SIMCA-P 14.1 软件进行PCA 和OPLS-DA 分析。

2 结果与分析

2.1 兰州百合稳定同位素和矿质元素含量的变异特征和地区差异

黄峪镇、西果园镇、中铺镇和阿甘镇4 个产区兰州百合的δ13C、δ15N、δ18O 等3 种稳定同位素和K、Mg、Ca、Na、B、Fe、Zn、Al、Mn、Cu、Mo、Cr、As、Se、Cd、Pb 等16 种矿质元素数据的平均值、极大值、极小值、标准误、标准差、变异系数等基本统计见表2，δ13C 值变幅为-25.22‰～-24.13‰，δ15N 值变幅为-3.06‰～6.48‰，δ18O 值变幅为26.00‰～30.47‰。矿质元素含量变幅为0.36 μg/kg（Pb）～13.55 g/kg（K），其中K 元素含量介于4.78～13.55 g/kg 之间，Pb 元素含量介于0.36～24.74 μg/kg 之间。通常认为变异系数≤0.1 为弱变异，0.1～1 之间为中等变异，变异系数≥1 为强变异，稳定同位素δ15N 变异系数为3.07，属于强变异；所测的16 种矿质元素变异系数介于0.12～0.88 之间，属于中等变异强度，其中Mo 元素的变异系数最大，为0.88。4 个产区元素含量的平均值和标准误差及多重比较如表3 所示，单因素方差分析结果显示δ13C、δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 差异显著（P＜0.05），Duncan 多重比较表明，黄峪镇和阿甘镇的样本δ13C 差异不显著（P＞0.05），但均显著（P＜0.05）高于西果园镇，δ15N 在黄峪镇、西果园镇和阿甘镇3 个产地间差异不显著（P＞0.05），但显著（P＜0.05）高于中铺镇；B 在西果园镇、阿甘镇、中铺镇3 个产地间均差异显著（P＜0.05），且西果园镇＞阿甘镇＞中铺镇，黄峪镇Cu、Cd 显著（P＜0.05）高于西果园镇，西果园镇K、Mg、Fe、Mn 显著（P＜0.05）高于中铺镇，中铺镇Cu、Mo、Cd 显著（P＜0.05）高于西果园镇，阿甘镇Na、Mn、Cr 显著（P＜0.05）高于中铺镇。

表2 兰州百合稳定同位素和矿质元素含量的变异特征Table 2 Variation characteristics of stable isotope and mineral element contents of Lanzhou lily

表3 主产区稳定同位素和矿质元素含量特征Table 3 Characteristics of stable isotope and mineral element contents in main producing areas

2.2 兰州百合主产区产地溯源的PCA 分析

对兰州百合δ13C、δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 进行PCA 分析。如表4 所示，基于特征值＞1 原则的前5 个主成分方差贡献率分别为36.88%、16.51%、11.06%、10.38%、9.54%，总方差贡献率84.36%，即前5 个主成分因子模型解释了84.36%的原数据，代表原始变量84.36%的信息。利用PCA 前两个主成分因子得分作X 轴、Y 轴绘制得分图，图1a 所示，兰州百合分为4 类，其中黄峪镇和中铺镇集中在第一主成分的正象限，西果园镇集中在第一主成分的负象限，阿甘镇数据间距离较大，聚类效果低于其它3 个产区。选择前两个主成分因子载荷值绘制载荷图，图1b 所示，第一轴K、Mg、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cd 载荷值较高，第二轴δ13C、δ15N、Cd、K、Mg、Cu 载荷值较高。δ13C、Cu、Mo与第一主成分显著（P＜0.05）正相关，δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cr、Cd 与第一主成分显著（P＜0.05）负相关；结果表明，兰州百合稳定同位素和矿质元素作为其产地识别指标可行，δ13C、δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 等变量可作为PCA 分析重要因子。

图1 PCA 前两个主成分因子得分图（a）和载荷图（b）Fig.1 Score plot (a) and load plot (b) of PCA along the two principal components axes

表4 兰州百合稳定同位素和矿质元素含量的主成分分析Table 4 Principal component analysis of stable isotope and mineral element contents of Lanzhou lily

2.3 主产区兰州百合产地溯源的OPLS-DA 判别分析

为排除干扰信息，进一步寻找兰州百合产区产生差异的主要标志物，进行OPLS-DA 判别分析，以δ13C、δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 为变量，构建的模型稳定可靠，其中R2X=0.63，R2Y=0.80，Q2=0.59，＞0.5。OPLS-DA 前两个主成分因子得分图见图2a，兰州百合样本各自聚为一类，明显区分为4 类，各部分间相互分离，表明4 个主产区兰州百合在OPLS-DA 模型中分类效果较好。VIP值见图2b，以VIP＞1 为标准，得到5 个差异标志物，即Na、δ15N、Cr、Cd、δ13C。说明Na、δ15N、Cr、Cd、δ13C 对区分不同产区百合的贡献较大，对构建模型的解释性和兰州百合的产地判别具有重要意义。对兰州百合样本进行内部验证，采用七折交叉验证和留一法交叉验证对其验证见表5，两种验证方法下4 个主产区判别正确率均为100%，说明OPLS-DA 模型适用兰州百合产地判别。

图2 OPLS-DA 前两个主成分因子得分图（a）和VIP 图（b）Fig.2 Score plot (a) and VIP plot (b) of OPLS-DA along the two principal components axes

表5 OPLS-DA 对兰州百合4 个主产区产地溯源的验证判别Table 5 Verification and discriminant of OPLS-DA for geographical origin traceability of the four main producing areas of Lanzhou lily

2.4 兰州百合主产区产地溯源LDA 判别分析

LDA 分析筛选确定δ13C、δ15N、Na、B、Cu、Cd、Cr 作为重要变量构建模型，根据Wilks 'lambda 值共拟合3 个判别函数，F1、F2、F3分别解释了总方差的60.8%、30.0%、9.2%。典型相关系数分别为：1.36、1.99、0.19，基于δ13C、δ15N、Na、B、Cu、Cd、Cr 建立的兰州百合判别函数如下：

通过绘制F1和F2检查判别空间中百合样品地理来源之间的距离，对其进行分类，如图3 所示，4 个产区兰州百合样品可以区分，但黄峪镇和中铺镇距离较近。将δ13C、δ15N、Na、B、Cu、Cd、Cr 作为判别指标，采用留一法交叉验证法对LDA 模型进行验证，结果见表6，对已知18 份样本的原始判别正确率为100%，留一法交叉验证正确率为88.89%，因此，δ13C、δ15N、Na、B、Cu、Cd、Cr 作为4 个产区的判别指标对其进行产地确证可行。4 个产区的Fisher 线性判别式函数如下：

图3 基于LDA 前两个主成分构建的兰州百合样品散点图Fig.3 Scatter plot of Lanzhou lily samples based on the first two principal components of LDA

表6 LDA 对兰州百合4 个主产区产地溯源的验证判别Table 6 Verification and discriminant of LDA for geographical origin traceability of the four main producing areas of Lanzhou lily

3 讨论

近年来，特色农产品、地理标志农产品备受关注，农产品品牌已经成为进入国内外市场的“流通名片”，在农业转型收益、农民增收等方面发挥重要作用。兰州百合极具兰州地方特色，是公认的品质优良的蔬菜和药材，于2004 年被列为地理标志产品。产地是兰州百合形成的一个重要原因。盲目引种、扩繁栽培可能导致其质量下降，生产销售等环节存在的以次充好、品质优劣层次不齐，增加了兰州百合安全事故发生的风险，不仅影响了兰州百合在国内外的市场需求和出口，而且威胁到消费者对于兰州百合安全食用的安全性。因此，加强从“农田到餐桌”的跟踪系统或从“餐桌到农田”的源头可追溯系统成为其质量保证的关键，且迫切需要建立兰州百合一种有效的可追溯方法。稳定同位素和矿质元素作为植物的天然“指纹”而成为其产地溯源确证的重要技术。植物生长代谢直接与环境进行物质、能量交换，体内的碳、氮、氧稳定同位素在物理、化学和生物化学过程中受土壤、气候、地形等因素影响发生自然分馏，导致同位素比值变化，使不同来源植物的同位素存在自然差异，进而反映所处环境[18-19]。植物的δ13C 值与光合作用途径密切相关，根据碳光合作用途径将其分为C3植物、C4植物和CAM 植物；C3植物δ13C 值介于-35‰～-20‰，C4植物δ13C 值介于-17‰～-9‰，CAM 植物δ13C 值介于-22‰～-10‰[20-21]。植物δ13C值还受温度、土壤水分、湿度、光照、CO2浓度等因素的影响[22]，具有地理特征。因此根据δ13C 值的差异，可进行农产品的产地溯源。兰州百合δ13C 值在-25.82‰～-24.05‰之间，属于C3植物，其δ13C 属于弱变异，原因是植物代谢活动对δ13C 的影响大于环境因子。植物δ18O 因水循环过程中扩散、蒸发、蒸腾等发生变化[23]，而农产品氧同位素主要来自灌溉水和产地降水[24-25]。兰州百合δ18O 无差异，可能其产地间灌溉水和降水量相差不大。植物中δ15N 值因气候、品种、肥料、土壤、降水量、温度等因素共同作用造成其δ15N 值差异较大[26]；另外，氮同位素分馏效应还受到农业生产的影响，农产品中15N/14N 的比值与其地区农业生产有关，其中农业施肥影响最大[27-28]。不同产地兰州百合δ15N 差异较大，黄峪镇δ15N 最高，可能在栽培过程中施用了绿色有机肥；而西果园镇和阿甘镇的δ15N 也显著高于中铺镇，可能与产地间施肥活动有关。

植物体内的矿质元素特征主要与其生长地域土壤中的矿质元素组成、土壤基质状况、施肥密切相关[29-30]；还与生长环境中的灌溉水、大气、气候，植物种类等因素有关[31]。农产品矿质元素是从土壤中吸收的无机元素离子，环境中矿质元素在其体内不断积累，造成不同地域来源农产品体内矿质元素含量有较大差异[32]。因此可以通过分析农产品矿质元素的组成差异，为其产地溯源提供独特的标识。本研究中，供试样本产地多以黄绵土、栗钙土和灰钙土为主，土壤质地以中壤土和轻壤土为主，由于土壤类型不同，土壤中所含的矿质元素不同，造成兰州百合生长过程中富集矿质元素存在差异，其次，产地间受人类施肥活动的影响，其吸收利用的矿质元素含量存在差异。在所测矿质元素含量中，K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 差异显著（P＜0.05）。虽然矿质元素含量在兰州百合产地判别方面存在显著差异，但需要结合多元统计学分析方法、综合分析多种因素才能更加准确的进行产地溯源，得到更理想的结果[33-34]。

鹿保鑫等[35]基于30 种矿质元素含量对黑龙江北安市及黑河市嫩江县42 份大豆产地溯源，并用模型确定Na、K、Mn、Rb、Ba 和Au 是区分两大产区的特征指标，判别正确率为100%。王洁等[36]追溯山东、四川、浙江、贵州扁茶，测定其同位素比率，并借助化学计量学工具探索稳定同位素溯源茶叶潜力，其模型预测准确度达到92%。张欣昕等[37]分析了基于稳定同位素和矿质元素含量对内蒙古、黑龙江、新疆、四川和广东的马铃薯进行产地判别，结果表明，δ13C 和δ15N 建立的产地判别模型判别正确率为82.0%，筛选出8 种矿质元素建立的产地判别模型正确判别率为89.3%；在稳定同位素和矿质元素的综合指标下，不同产地的整体判别正确率94.7%，交叉验证判别正确率93.2%，均比稳定同位素和矿质元素独立判别正确率高，说明稳定同位素和矿物元素指标组合是马铃薯产地溯源的有效方法。本研究测定了测定兰州百合4 个主产区（阿甘镇、黄峪镇、西果园镇、中铺镇）3 种稳定同位素和16 种矿质元素含量并分析产地间特征及差异，结合PCA、OPLS-DA 和LDA分析，追溯兰州百合地理来源，确定δ13C、δ15N、Na、Cr、Cd 是区分兰州百合地理来源的重要变量，有监督的分类模型OPLS-DA 判别效果优于LDA,正确率为100%。结果证明稳定同位素比率和矿物元素指纹联合是追溯兰州百合产地的有效指纹技术。

4 结论

本研究利用IRMS 和ICP-MS 测定兰州百合3 种稳定同位素δ13C、δ15N、δ18O 和16 种矿质元素（K、Mg、Ca、Na、B、Fe、Zn、Al、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd、Se、As、Pb）含量并分析产地间特征及差异，并结合PCA、OPLS-DA、LDA 模型进行溯源验证。结果表明：δ13C、δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 在产地间存在显著差异（P＜0.05）；基于差异显著（P＜0.05）的稳定同位素和矿质元素含量的PCA分析和OPLS-DA 判别分析表明δ13C、δ15N、Na、Cd、Cr 在兰州百合产地溯源确证中发挥重要作用。OPLSDA 和LDA 模型判别正确率均为100%，但LDA的LOO-CV 判别正确率为88.89%，OPLS-DA 优于LDA，为100%，产地溯源判别验证效果最佳。由此可见，稳定同位素和矿质元素含量结合多元统计分析可有效实现兰州百合产地区域的正确区分。其中，LDA 和OPLS-DA 模型均能够对黄峪镇、西果园镇、阿甘镇和中铺镇样品100%准确识别。因此，可进一步扩展研究区域，结合分类模型筛选贡献率较大的指标构建新的模型，实现兰州百合精细判别，为兰州百合产地溯源、质量安全可追溯体系的建立完善和开发应用提供一定的理论依据。