基于蛋白质组学分析尿嘧啶对出芽短梗霉产普鲁兰多糖的影响

陈世伟，唐淑贤，王舸楠，吴程远，张淑慧，赵廷彬，殷海松，郑志强，乔长晟,,5,6,

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.天津慧智百川生物工程有限公司，天津 300457；3.天津现代职业技术学院生物工程学院，天津 300457；4.军事科学院系统工程研究所军需工程技术研究所，北京 101300；5.工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室，天津 300457；6.天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津 300457）

普鲁兰多糖又叫普鲁兰糖，短梗霉多糖或茁霉多糖，主要由出芽短梗霉所分泌的一种线性胞外多糖。普鲁兰多糖通过麦芽三糖重复单元经α-1,6 糖苷键聚合而成，因此又被叫做聚麦芽三糖[1-2]。普鲁兰多糖是一种水溶性多糖，分子质量在4.5×104～6×105Da[3]。普鲁兰多糖独特的物理和化学性质使其在食品、化妆品、制药和生物医药行业中具有广泛的应用前景。Mert 等[4]将普鲁兰多糖与丙烯酸-衣康酸共价制备成水凝胶用于伤口敷料。普鲁兰多糖能够形成透明、耐油和不渗透氧气的薄膜用于食品包装[5]。作为淀粉的替代品用于加工食品和口腔护理产品中[6]。除了其优良的风味保持性能外，其在运输和传递生物活性化合物方面的性质使其成为生物医学和制药应用的理想选择材料[7]。普鲁兰多糖因其极高的商业价值在科研领域中始终保持着空前的热度。因此，对普鲁兰多糖生物合成代谢机理的研究，以提高其产量具有重要的意义。

碱基和核苷是一类化合物，在编码遗传信息、信号传递和能量代谢等重要生理功能中起着重要作用[8]。尿嘧啶作为一种核苷酸类生长因子可以调控微生物的生长代谢活动。West 等[9]研究发现，在培养基中添加尿嘧啶可以增加农杆菌的凝乳菌产量。Lee 等[10]在培养基中添加尿嘧啶可提高猴头菌胞外多糖的产生。Saleh 等[11]研究发现在饲料中添加尿嘧啶，可促进鱼类的生长。Sheng 等[12]研究了尿嘧啶对普鲁兰产量、生物量和尿苷磷酸化酶（UPase）活性的影响。但是关于尿嘧啶对出芽短梗霉产普鲁兰多糖代谢机理的研究，目前尚未报道。

本文通过对培养基进行优化，在培养基中添加生长因子尿嘧啶，研究其对普鲁兰多糖产量的影响。并通过Label-free 蛋白质组学技术对添加尿嘧啶对普鲁兰多糖发酵后期（88 h）的出芽短梗霉胞内蛋白质的差异进行了生物学分析，为了解尿嘧啶对出芽短梗霉合成普鲁兰多糖的代谢机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNO.7055；蔗糖 广西田东县制糖有限公司；酵母浸粉 维科特化工产品贸易有限公司；硫酸铵、硫酸亚铁 天津博迪化工股份有限公司；磷酸氢二钾 北京奥博星生物技术有限公司；硫酸镁淄博川北化工有限公司；氯化钠 维科特化工产品贸易有限公司；所有试剂 均为国产分析纯；种子培养基（g/L）：蔗糖100，酵母浸粉3，（NH4）2SO41，K2HPO42，MgSO40.4，NaCl 2.5，FeSO40.05，用6.0 mol/L HCl 及6.0 mol/L NaOH 溶液 调节pH 至6.0，然后于121 ℃下灭菌20 min；发酵培养基（g/L）：蔗糖150，蛋白胨5，MgSO40.4，NaCl 3，K2HPO47，FeSO40.05，用6.0 mol/L HCl 及6.0 mol/L NaOH 溶液调节pH 至6.0，然后于121 ℃下灭菌20 min。其中实验组为在发酵48 h 时向发酵培养基中添加0.5 g/L的尿嘧啶。

SBA-40E 生物传感器 山东省科学院生物研究所；5 L 自动发酵罐08-F25 型 镇江格瑞生物工程有限公司；TDL-5-A 型高速离心机 上海安亭科学仪器厂；5977B-7890B 气相质谱联用仪 德国安捷伦科技有限公司；LC-20A 高效液相色谱系统 日本岛津。

1.2 实验方法

1.2.1 种子培养 将4 ℃冰箱中保存待用的斜面取出，放在28 ℃恒温培养箱中进行活化，时间为2～3 h。然后从活化好的斜面中挑一环孢子快速接到种子培养基中，最后放置在摇床中培养，培养条件为180 r/min，28 ℃，培养时间为28～32 h。

1.2.2 发酵培养 摇床发酵培养：将培养好的种子液，以3%（v/v）的接种量接入到发酵培养基中，本文采用两阶段控温培养，发酵前24 h 为32 ℃，发酵后64 h 温度调为28 ℃，转速为400 r/min，培养周期为88 h。

发酵罐发酵培养：装液量为3 L，接种量为3%（v/v）即900 mL 种子液，初始pH 调至6.0，通风比为1:1.25 vvm，罐压为0.02 MPa，转速为400 r/min，本文采用两阶段控温培养，发酵前24 h 为32 ℃，发酵后64 h 温度调为28 ℃，转速为180 r/min，培养周期为88 h。

尿嘧啶最适添加量的优化方法：初始添加量分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L，按照摇床发酵培养方法进行培养。

尿嘧啶最适添加时间的优化方法：空白组为不添加尿嘧啶，实验组添加时间分别为0、24、48、72 h，按照摇床发酵培养方法进行培养。

1.2.3 分析方法 残糖的测定：参照文献[13]试验方法，将发酵液离心，取上清液1 mL 稀释100 倍定容，用生物传感器测定含量。

产量的测定：参照文献[14]试验方法，取上述上清液30 mL 加入60 mL 无水乙醇，搅拌均匀放置1 h 后抽滤，所得多糖放在60 ℃烘箱中烘干至恒重并称重，按照式（1）计算得出普鲁兰多糖的产量。

式中：m 表示普鲁兰多糖产量，g/L；m1表示干燥滤纸的重量，g；m2表示普鲁兰多糖与干燥滤纸的总量，g。

菌体量的测定：将5 mL 发酵液于10 mL 离心管中离心，去上清置于60 ℃烘箱中，烘干至恒重称重，按照式（2）计算得出菌体量。

式中：m 表示出芽短梗霉菌体量，g/L；m1表示离心管干重，g；m2表示出芽短梗霉菌体量与离心管总重，g。

1.2.4 蛋白质组学实验方法

1.2.4.1 样品的制备与提取 取适量培养至88 h 的发酵液于5 mL 离心管中，于4 ℃，5000 ×g 下冷冻离心15 min，将上清液去除掉留菌体，使用PBS 溶液对菌体进行洗涤，重复三次，最后将菌体用液氮进行速冻，保存至-80 ℃下备用。本文采用SDT 裂解法[15]。向样品中加入一定量的SDT 裂解液进行超声，超声条件设置为：80 W，工作10 s 间歇15 s 重复此过程10 次，之后进行沸水浴，时间为15 min。然后将样品于14000 ×g 下离心40 min 取上清。本文对蛋白质进行定量使用的是BCA 法。最后样品分装好后，于-80 ℃下保存备用。

1.2.4.2 酶解脱盐及质谱分析 参照Zhou 等[16]的方法。酶解后使用C18 Cartridge 对肽段进行脱盐，然后将肽段冻干后加40 μL 0.1%的甲酸溶液进行复溶，肽段定量。质谱分析使用纳升流速的HPLC 液相系统Easy nLC。

1.3 数据处理

实验数据为3 组平行样品计算结果的平均值。Origin 2020 软件作图。GO 和KEGG 的注释用Uniprot的Yeast 注释数据完成。使用MaxQuant 软件（版本号1.5.3.17）[17]对质谱分析出来的原始数据与数据库进行比对鉴定，然后进行定量分析。相关的数据参数和说明如表1 所示。

表1 搜库参数Table 1 Parameters of searching

2 结果与分析

2.1 尿嘧啶对普鲁兰发酵的影响

2.1.1 尿嘧啶最佳添加量 在摇瓶发酵条件下，不同的尿嘧啶添加量对出芽短梗霉细胞生长和普鲁兰合成的影响结果如图1 所示。添加不同浓度的尿嘧啶，对普鲁兰多糖的产量和菌体量均有一定的促进作用。特别是，添加0.5 g/L 的尿嘧啶对普鲁兰多糖的产量提高最高，由66.13 g/L 提高到73.47 g/L，相比对照提高了11%，同时，菌体量从11.68 g/L 提升到12.89 g/L，相比空白组提高10%。这可能是因为尿嘧啶的加入，影响了普鲁兰合成途径中某些关键酶的活性，刺激了糖酵解等代谢途径，有利于合成普鲁兰和菌体的生长。结果表明，发酵培养基中尿嘧啶的存在有利于普鲁兰多糖产量的提高，这与Sheng 等[12]的研究结果一致，且其浓度为0.5 g/L 时，有最大的促进作用。

图1 不同浓度梯度尿嘧啶对普鲁兰发酵的影响Fig.1 Effects of different concentration gradients of uracil on the fermentation of pululan

2.1.2 尿嘧啶最佳添加时间 图2 显示了不同时间添加尿嘧啶对普鲁兰发酵的影响。由图2 分析可知，尿嘧啶在不同时间添加对普鲁兰多糖的产量具有明显的差异。从图2 中可以看出，在48 h 添加0.5 g/L 的尿嘧啶对普鲁兰多糖的产量提高最高，由65.6 g/L 提高到79.5 g/L，相比对照提高了21%。尿嘧啶的添加时间为48 h 对普鲁兰多糖的产量有最大的促进作用。这可能是因为添加尿嘧啶后为出芽短梗霉合成普鲁兰多糖提供了更多的UDPG 前体物。在出芽短梗霉生长的中后期阶段可以大量合成普鲁兰多糖这一次级代谢产物，然而在中后期阶段UDPG 的含量最少，此时添加尿嘧啶为出芽短梗霉合成普鲁兰多糖提供了更多的前体物质。

图2 不同时间添加尿嘧啶对普鲁兰发酵的影响Fig.2 Effects of uracil addition at different time on pullulan fermentation

2.1.3 尿嘧啶对普鲁兰多糖合成影响的发酵动力学上述实验得出在发酵48 h 时添加0.5 g/L 的尿嘧啶对出芽短梗霉合成普鲁兰多糖的效果最佳，从发酵动力学方面来研究尿嘧啶对合成普鲁兰多糖的影响。根据图3 可以看出，在发酵前48 h 内，空白组与实验组的菌体量、产量等指标并无明显变化。在48 h加入尿嘧啶后，实验组普鲁兰多糖产量为86.27 g/L，较空白组的70.13 g/L 提高了23%，然而，实验组的菌体量小于对照组，这表明普鲁兰多糖的产量与出芽短梗霉菌体量并无直接关系，这与Sheng 等[12]的研究结果一致。为了解尿嘧啶对出芽短梗霉产普鲁兰多糖内在机理的影响，下面从蛋白质组学的角度进行分析。

图3 尿嘧啶对普鲁兰多糖发酵的影响Fig.3 Effects of uracil on the fermentation of pullulan polysaccharide

2.2 蛋白质组学分析

2.2.1 差异表达蛋白质的定量及统计分析结果 以变化倍数大于2.0 倍（上调大于2 倍或者下调小于0.5）且Pvalue 小于0.05 的筛选标准筛选差异表达蛋白质，实验组与空白组的差异表达蛋白质数目如表所示。

由表2 可以看出，空白组和实验组中共筛选出80 个差异蛋白，其中上调蛋白有40 个，下调蛋白有40 个。

表2 差异蛋白结果统计Table 2 Differential protein results statistics

2.2.2 差异表达蛋白质的聚类分析结果 采用层次聚类算法（Hierarchical Cluster）对差异性表达蛋白进行聚类分析，数据用图4 表示。红色代表显著性上调蛋白，蓝色代表显著性下调蛋白，颜色越深差异越明显。在阈值条件下选择倍数变化大于2 的差异蛋白进行分析。参与主要代谢途径的部分差异蛋白如表3 所示，其中表达量上调的蛋白质包括己糖激酶、6-磷酸果糖激酶-2 和异柠檬酸裂解酶，表达量下调的蛋白质包括苹果酸酶。

表3 差异蛋白结果统计Table 3 Differential proteins statistics

图4 空白组和实验组差异蛋白质聚类分析Fig.4 Differential protein cluster analysis of blank and experimental groups

2.2.3 差异表达蛋白质的基本本体功能富集分析结果 基因本体（Gene Ontology，简称GO）作为生物信息领域中一个极为重要的方法和工具，能够从更加概括或者系统的方面对研究的蛋白质和蛋白质的功能进行更加深入的分析。GO 分析分为三个方面，分别为生物过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和细胞组分（Cellular Component，CC）。通过对实验组和空白组差异蛋白的GO 功能富集分析，得到的结果如图5 所示。

由图5 可以看出，差异蛋白质参与了磷脂生物合成过程、甘油磷脂生物合成过程、甘油脂生物合成过程等重要生物学过程。差异蛋白质在分子功能上的体现在磷脂酰丝氨酸脱羧酶活性、碳-碳裂解酶活性、羧基裂解酶活性、含氧酸裂解酶活性、碳水化合物激酶活性。同时，在纺锤体、微管组织中心、细胞内囊泡等定位蛋白质，发生了显著变化。

图5 差异蛋白GO 功能富集分析（Top 20）Fig.5 GO functional enrichment analysis of differential proteins (Top 20)

2.2.4 差异表达蛋白质的代谢通路分析结果 通过对本文所鉴定到的差异性蛋白进行KEGG 功能注释分析，所得到的统计结果如图6 所示。

通过对鉴定出来的差异蛋白进行KEGG 功能注释，将其按照所属的不同代谢途径进行功能分类。并对不同途径中富集到的蛋白数目进行统计，按照蛋白统计数目排列出前20 的代谢通路，统计注释结果如图6 所示。本文所研究的差异蛋白主要涉及的KEGG 途径包括：核糖体、甘油磷脂代谢、氧化磷酸化、RNA 转运、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、糖酵解、嘧啶代谢、果糖和甘露糖代谢和丙酸代谢。由此可见，上述代谢途径均可能与普鲁兰多糖产量的变化有关。

图6 差异蛋白KEGG 通路注释Fig.6 Differential protein KEGG pathway annotations

2.2.5 差异表达蛋白质的代谢途径分析结果 随着质谱技术的革新，极大增强了蛋白质组学技术测量的精度和可靠性[18]。蛋白质组学方法也是揭示细胞和生物体在系统水平上的生物学功能、代谢网络和功能性蛋白质相互作用网络的有效工具[19]。以此，根据筛选出的差异蛋白质，结合代谢通路分析结果，绘制了尿嘧啶引起的差异蛋白对出芽短梗霉代谢途径的影响图，如图7 所示。

图7 尿嘧啶引起的差异蛋白对出芽短梗霉代谢途径的影响Fig.7 Effect of differential protein induced by uracil on metabolic pathway of Aureobasidium pullulans

由表3 可以看出表达量上调的蛋白质包括己糖激酶、6-磷酸果糖激酶-2 和异柠檬酸裂解酶，表达量下调的蛋白质包括苹果酸酶。这些蛋白涉及到出芽短梗霉细胞胞内的糖酵解、果糖和甘露糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、丙酮酸代谢和TCA 循环等代谢途径。

己糖激酶被定义为磷酸化葡萄糖和其他紧密相关的己糖（甘糖、2-脱氧葡萄糖、葡萄糖胺和果糖）的第六碳上的酶，是参与磷酸化己糖的关键酶[20]。在糖酵解、果糖和甘露糖代谢途径中己糖激酶可以催化D-葡萄糖形成D-6 磷酸葡萄糖、D-甘露糖形成D-6 磷酸甘露糖。D-6-磷酸葡萄糖可以转化为D-1-磷酸葡萄糖，D-1-磷酸葡萄糖再转化为UDPG，其为普鲁兰糖合成的前体物质[21]。而D-6 磷酸甘露糖可以进一步异构化形成β-D-6 磷酸果糖，后者进入糖酵解反应中。因此，己糖激酶的表达量上调，一方面导致了UDPG 水平上涨，另一方面促进了糖酵解反应的进行，从而提高普鲁兰多糖合成。

6-磷酸果糖激酶-2 在糖酵解代谢中可以催化D-6 磷酸果糖形成2,6-二磷酸果糖。而2,6-二磷酸果糖是6-磷酸果糖激酶-1 的最强激活剂同时也是糖异生途径1,6-二磷酸果糖酶的抑制剂，其也是丙酮酸激酶的激活剂。6-磷酸果糖激酶-1 作为糖酵解途径中的限速酶，因为2,6-二磷酸果糖的增多可以降低ATP、柠檬酸对其的抑制作用，从而促使6-磷酸果糖激酶-1 的活性增强。因此，6-磷酸果糖激酶-2 的表达量上调，使6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶的活性增强，1,6-二磷酸果糖酶的活性下降，这种三重调节作用的结合，解除了糖酵解反应的速率限制，从而提高糖原的利用效率。

异柠檬酸裂解酶在醛酸和二羧酸代谢过程中可以促进异柠檬酸分解成琥珀酸。琥珀酸在TCA 循环中是一种必不可少的物质，而琥珀酸含量的增加有利于TCA 循环的进行。TCA 循环是在线粒体中运行的一种双向通路，在大多数真核生物中已成为一个中心代谢中枢，是能量代谢的中心过程[22]。因此异柠檬酸裂解酶的表达量上调使TCA 循环更加高效的进行。

苹果酸酶在丙酮酸代谢过程中是催化苹果酸生成丙酮酸的关键酶，苹果酸酶的表达量下调，从而抑制了苹果酸生成丙酮酸。Xue 等[23]研究了过表达苹果酸-丙酮酸途径可促进脂肪酸的生物合成。而苹果酸酶的表达量下降，积累的苹果酸有助于TCA 循环的进行，从而为出芽短梗霉菌体的生长和普鲁兰多糖的合成提供了更多的能量。

3 结论

通过Label-free 技术研究了添加尿嘧啶对出芽短梗霉合成普鲁兰多糖过程中胞内蛋白质的变化，结果表明共筛选出80 个差异性蛋白质，其中包括40个上调蛋白和40 个下调蛋白。GO 功能富集分析发现两组间的差异蛋白主要参与磷脂生物合成过程、甘油磷脂生物合成过程以及蛋白质的转运过程等。通过对本文所鉴定到的差异蛋白进行KEGG 功能注释分析发现差异蛋白主要涉及的KEGG 途径包括氧化磷酸化、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、糖酵解、果糖和甘露糖代谢和丙酸代谢等代谢途径。结合出芽短梗霉合成普鲁兰多糖的代谢途径分析两组间的差异蛋白，发现己糖激酶的表达量上调，增强了糖酵解和果糖和甘露糖相关代谢途径，为出芽短梗霉合成普鲁兰多糖提供了更多的UDPG 前体物质；6-磷酸果糖激酶-2 表达量上调，促进了糖酵解反应的高效进行；异柠檬酸裂解酶的表达量上调促进了乙醛酸和二羧酸代谢，苹果酸酶的下调抑制了丙酮酸代谢，这两个途径可间接增强TCA 循环，从而为出芽短梗霉菌体的生长和普鲁兰多糖的合成提供了更多的能量。研究结果有助于理解尿嘧啶在普鲁兰生物合成中的作用机制，为进一步提高普鲁兰的产量提供了新途径。