白黎芦醇对小鼠卵巢早衰的干预作用及可能机制

修银玲孙凯旋于月新

(中国人民解放军北部战区总医院 生殖医学科,沈阳 110000)

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指女性在40 岁前由于卵巢内卵泡提前衰竭或卵泡发育停滞,导致的卵巢功能丧失[1]。 POF 的特点是雌激素水平低下,促性腺激素(Gn)水平升高,与绝经后妇女相同[2]。 近几年,卵巢早衰的发病率有上升趋势,研究认为POF 与染色体缺陷、毒素暴露和自身免疫性疾病有关,但多数患者病因尚不明确。 经典的化疗药物如环磷酰胺(CTX)和白消安(BU)具有严重的生殖毒性,常用于构建POF 动物模型[3]。

白藜芦醇(resveratrol,RES)是一种多酚类天然植物抗毒素,广泛存在于葡萄、果桑和其他植物中,它具有多种药理作用,如抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗氧化、细胞保护、抗凋亡等[4]。 文献报道,RES 可以通过降低LH、LH/FSH 比值和TNF-α 水平来改善卵泡发育[5]。 本研究观察RES 对卵巢早衰小鼠的干预作用,并通过检测Wnt/β-catenin 信号通路和抗氧化等指标,探讨其可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级8 周龄雌性C57BL/6 小鼠40 只,体重(20±0.5)g,由辽宁长生生物技术有限公司提供 [SCXK(辽)2017-0001],小鼠饲养于北部战区总医院动物实验科[SYXK(辽)2018-0021],本研究经北部战区总医院动物伦理委员会批准(202005068),所有动物实验符合3R 指导原则。

1.2 主要试剂与仪器

白藜芦醇(美国Sigma 公司,货号L1645);环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX,美国Sigma 公司,货号C0768)和白消安(Busulfan,BUS,美国Sigma 公司,货号B2635);兔抗鼠β-catenin 抗体(美国Sigma公司,批号SAB4501254);兔抗鼠Mvh 抗体(美国Sigma 公司,批号SAB540697);兔抗鼠Oct4 抗体(美国Sigma 公司,批号ZRB100);兔抗鼠SOD2 抗体(美国Sigma 公司,批号T4929);兔抗鼠Nrf2 抗体(美国Sigma 公司,批号SAB4501926);兔抗鼠Bax抗体(美国Sigma 公司,批号A5367);兔抗鼠Bcl-2抗体(美国Sigma 公司,批号A8924);荧光定量 PCR试剂盒(TaKaRa 公司,批号SR1110-200T);PCR 引物(Invtrogen 公司);免疫组化试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司,批号14E25L13D124)。 蛋白电泳仪(美国Bio-Rad 公司); 显微镜购自日本OLYMPUS 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

C57BL/6 小鼠经腹腔注射CTX(120 mg/kg)和BU(30 mg/kg)制成POF 模型,观察4 周。 将RES 溶解于生理盐水中,造模同时灌胃给药28 d。 将小鼠分为4 组:对照组(Control)、模型组(Model group)、20 mg/kg RES 组(20 mg/kg RES group)和40 mg/kg RES 组(40 mg/kg RES group),每组10 只。 在治疗最后1 d 测量并记录小鼠和卵巢的重量。

1.3.2 苏木精-伊红(HE)染色观察卵巢组织与卵泡计数

取小鼠卵巢组织,4%多聚甲醛固定过夜,石蜡包埋。 HE 染色后观察卵巢形态特征,计算闭锁率(闭锁卵泡占卵泡总数的比例)和原始卵泡率(原始卵泡占卵泡总数的比例)。

1.3.3 RT-qPCR 检测CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA 表达

采用TRIzol 试剂提取卵巢总RNA,按照PrimeScript RT-kit 方法,通过逆转录获得cDNA,并按照TB-Green-Mix-kit 说明书进行RT-qPCR。 表1列出了RT-qPCR 引物序列,内参采用GAPDH。

表1 引物序列(5’-3’)Table 1 Primer sequence

1.3.4 免疫组化染色观察卵巢组织β-catenin 蛋白表达

卵巢组织石蜡切片经脱蜡、水化,3%过氧化氢中孵育10 min,阻断非特异性反应,切片加β-catenin一抗孵育4 h,然后加辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗处理15 min,DAB 显色试剂盒显色,苏木素轻度复染,脱水,透明,中性树胶封片,以PBS 溶液作为一抗的阴性对照。

1.3.5 Western blot 法检测Mvh、Oct4、β-caterin、SOD2、Nrf2、Bax 和Bcl-2 蛋白表达

取各组小鼠卵巢组织50 μg,RIPA 裂解液提取总蛋白,BCA 蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGF)电泳后转移到PVDF 膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h 后,加入一抗,4℃孵育过夜,将膜清洗3 次,然后二抗室温孵育2 h,用凝胶图像分析成像系统进行扫描分析,结果以目的蛋白相对表达量表示,目的蛋白相对表达量=目的蛋白IOD 值/内参β-actin IOD 值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 进行数据分析,数据以平均数±标准差(±s)表示,两组间的统计学差异采用t检验,多组数据采用单因素方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体重、卵巢重量和卵巢/小鼠相对重量比

与模型组相比,20 mg/kg RES 组和40 mg/kg RES 组小鼠卵巢体积明显变大;20 mg/kg RES 组和40 mg/kg RES 组小鼠体重、卵巢重量和卵巢/小鼠重量比均高于模型组,见图1、表2。

表2 小鼠重量、卵巢重量和卵巢/小鼠重量比(±s,n=10)Table 2 Mice weight, ovary weight and ovary/mice weight ratio

表2 小鼠重量、卵巢重量和卵巢/小鼠重量比(±s,n=10)Table 2 Mice weight, ovary weight and ovary/mice weight ratio

注:与对照组相比,∗∗P<0.01;与模型组相比, ##P<0.01。Note.Compared with the control group, ∗∗P<0.01.Compared with the model group, ##P<0.01.

组别Groups小鼠重量(g)Mice weight卵巢重量(g)Ovarian weight卵巢/小鼠重量比Ovary/mice weight ratio对照组Control group 39.42±1.14 0.0310±0.0027 0.000786±0.000049模型组Model group 25.60±0.66∗∗ 0.0067±0.0014∗∗ 0.000265±0.000054∗∗20 mg/kg RES 组 20 mg/kg RES group 30.24±1.57## 0.0157±0.0025## 0.000519±0.000077##40 mg/kg RES 组 40 mg/kg RES group 33.50±0.87## 0.0204±0.0028## 0.000608±0.000085##

图1 各组小鼠卵巢形态比较Figure 1 Comparison of ovarian morphology between groups of mice

2.2 HE 染色观察小鼠卵巢组织的病理变化

与对照组相比,模型组小鼠原始卵泡数量下降(P<0.01),而与模型组相比,20 mg/kg RES 组和40 mg/kg RES 组小鼠原始卵泡数量增加(P<0.05)。

与对照组相比,模型组小鼠闭锁卵泡数量增加(P<0.01),而与模型组相比,20 mg/kg RES 组和40 mg/kg RES 组小鼠闭锁卵泡数量下降(P<0.05),见图2、图3。

2.3 小鼠卵巢中CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA 表达

与对照组比,模型组小鼠卵巢组织中CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA 表达下降(P<0.01),而与模型组比,20 mg/kg RES 组和40 mg/kg RES 组小鼠卵巢组织中CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA 表达增加(P<0.05),见图4。

注:与对照组相比,∗∗∗P<0.01;与模型组相比, ##P<0.05, ###P<0.01。图3 小鼠卵巢中原始卵泡和闭锁卵泡比例(±s,n=10)Note.Compared with the control group,∗∗∗P<0.001.Compared with the model group, ##P<0.05, ###P<0.001.Figure 3 Ratio of the primordial and atresia follicles in the ovaries

注:与对照组比,∗∗P<0.01;与模型组比, #P<0.05,##P<0.01。图4 小鼠卵巢组织中CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA相对表达量(±s,n=10)Note.Compared with the control group, ∗∗P<0.01.Compared with the model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 4 Relative expression level of CyclinD1, Wnt1 and β-catenin mRNA in mouse ovarian tissue

注:箭头所指示均为成熟卵泡。图2 白黎芦醇对小鼠卵巢组织的影响(HE)Note.Arrows indicate mature follicles.Figure 2 Effect of resveratrol on ovarian tissue of mice

2.4 卵巢组织中β-caterin 蛋白表达情况

与对照组比,模型组小鼠卵巢组织中β-caterin阳性蛋白表达下降,而与模型组比,20 mg/kg RES组和40 mg/kg RES 组小鼠卵巢组织中β-caterin 阳性蛋白表达升高,见图5。

图5 小鼠卵巢组织中β-catenin 蛋白表达(免疫组化)Figure 5 Protein expression of β-catenin in mice ovarian tissue (immunohistochemistry)

2.5 卵巢组织中Mvh 和Oct4 蛋白表达情况

与对照组相比,模型组小鼠卵巢组织中Mvh 和Oct4 蛋白表达下降(P<0.001),而与模型组相比,20 mg/kg RES 组和40 mg/kg RES 组小鼠卵巢组织中Mvh 和Oct4 蛋白表达升高(P<0.05),且呈浓度依赖性,见图6。

2.6 卵巢组织中SOD2、Nrf2、Bax 和Bcl-2 蛋白表达情况

与对照组相比,模型组小鼠卵巢组织中SOD2、Nrf2 和Bcl-2 表达下降,Bax 表达升高(P<0.001);与模型组相比,20 mg/kg RES 组和40 mg/kg RES 组小鼠卵巢组织中SOD2、Nrf2 和Bcl-2表达升高,Bax 表达下降(P<0.001),且呈浓度依赖性,见图7。

3 讨论

40 岁前自然绝经这一临床现象称之为卵巢功能早衰,是危害女性健康的重要因素之一,目前各种中西医治疗方法效果均不理想[6]。 因此,为恢复卵巢功能寻找替代治疗药物至关重要。 白黎芦醇是一种存在于多种植物中的非黄酮类多酚化合物,它具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化等多方面的药理活性[7]。 在癌细胞中,RES 具有强大的抗炎作用和抗氧化作用,并发现可诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞[8-9]。

本实验中,模型组小鼠体重、卵巢重量低于对照组;HE 染色观察发现,与对照组比较,模型组小鼠卵巢体积和成熟卵泡数量减少,而闭锁卵泡数量增加;Western blot 检测发现,POF 小鼠卵巢Mvh 和Oct4 蛋白表达低于对照组,这些结果说明POF 小鼠建模成功[10]。

注:与对照组相比, ∗P<0.05,∗∗P<0.01;与模型组相比, ##P<0.01。图6 白黎芦醇对卵巢组织中Mvh 和Oct4 蛋白表达的影响(±s,n=10)Note.Compared with the control group, ∗P<0.05,∗∗P<0.01.Compared with the model group, # #P<0.01.Figure 6 Effect of resveratrol on the expression of Mvh and Oct4 proteins in ovarian tissues

注:与对照组相比, ∗P<0.05,∗∗P<0.01;与模型组相比, #P<0.05, ##P<0.01。图7 白黎芦醇对卵巢组织中SOD2、Nrf2、Bax 和Bcl-2 蛋白表达的影响(±s,n=10)Note.Compared with the control group, ∗P<0.05,∗∗P<0.01.Compared with the model group, # P<0.05, # #P<0.01.Figure 7 Effect of resveratrol on the expression of SOD2, Nrf2, Bax and Bcl-2 proteins in ovarian tissues

白黎芦醇能消除POF 的免疫损伤,恢复卵巢功能,但其具体机制尚不明确[11]。 Mvh 是生殖细胞标志基因,Oct4 是胚胎干细胞标志物,通常以Mvh 和Oct4 作为指标评价雌性生殖干细胞(FGSCs)在小鼠体内的存活情况[12]。 HE 染色观察发现,20 mg/kg RES 组和40 mg/kg RES 组小鼠原始卵泡数量低于对照组,但高于模型组;Western blot 法检测发现,RES 组Mvh 和Oct4 蛋白表达高于模型组,提示RES可能通过维持FGSCs 的存活来保护卵巢功能,这与HE 染色观察结果基本一致。

Wnt/β-catenin 通路是经典的Wnt 通路,参与机体许多重要生理活动,包括胚胎早期发育、生殖系统发育等[13]。 β-catenin 蛋白是Wnt 通路激活的重要标志,已被证明能持续增强FSH 分泌,促进卵泡发育[14];CyclinD1 位于β-catenin 下游,是重要的细胞周期调控蛋白[15-16]。 免疫组化观察发现,模型组卵巢组织中β-caterin 蛋白表达低于对照组,说明在POF 小鼠卵巢组织中,β-caterin 表达下调,会抑制卵泡发育,可能对卵巢功能有一定影响,而RES 组βcaterin 阳性蛋白表达升高,且呈浓度依赖性,提示RES 可能上调β-caterin 表达,增强FSH 分泌,促进卵泡发育;RT-qPCR 法检测发现,RES 组CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA 表达均高于模型组,且40 mg/kg RES 组β-catenin mRNA 表达高于20 mg/kg RES 组。 这些结果进一步说明RES 可能通过上调Wnt1 mRNA 表达,使细胞质中的β-catenin mRNA表达增加,进入细胞核,从而激活Wnt/β-catenin 通路的下游靶基因CyclinD1 mRNA,促进卵泡发育,有助于卵巢功能恢复,这与免疫组化观察结果基本一致。

Nrf2、HO-1 和SOD 是体内抗氧化应激和维持氧化还原平衡的几个重要因子。 超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内重要的抗氧化酶,可分为SOD1、SOD2 等,具有清除自由基,保护机体免受氧自由基损[17-18]。 Nrf2 为调控机体抗氧化应激反应的核转录因子,能够显著诱导机体的内源性抗氧化应答[19]。 Western blot 检测发现,模型组SOD2 和Nrf2蛋白表达低于对照组(P<0.05),提示POF 可抑制SOD2 和Nrf2 蛋白表达,导致ROS 积累,使卵巢功能受损。 而RES 组SOD2 和Nrf2 蛋白表达高于模型组(P<0.05),且呈浓度依赖性,提示当POF 诱发卵巢氧化应激时,RES 可促进Nrf2 激活并进入细胞核,启动下游抗氧化基因SOD2 表达,起到清除自由基作用,延缓卵巢衰老。

Bax 和Bcl-2 均是Bcl-2 家族的重要分子,Bcl-2为抗凋亡蛋白,而Bax 为促凋亡蛋白。 Western blot检测发现,与对照组比较,模型组小鼠卵巢组织中Bcl-2 表达下降,Bax 表达升高,说明POF 可促进卵巢细胞凋亡,损害卵巢功能;与模型组比较,RES 组Bcl-2 表达增加,Bax 表达减少,说明RES 可抑制卵巢细胞凋亡,提高细胞存活率。

综上所述,白藜芦醇对卵巢早衰小鼠具有保护作用,其机制可能与抑制卵巢细胞凋亡,以及激活Wnt/β-catenin 通路促进卵巢功能恢复有关。