基于数据挖掘的慢性阻塞性肺疾病模型应用分析

李 磊吴东良李尚点阎 玥史 琦李春雷李友林∗

(1.北京中医药大学,北京 100029;2.中日友好医院 中医肺病二部,国家中医药管理局重点研究室(肺病慢性咳喘),中医药防治过敏性疾病北京市重点实验室(BZ0321),中日友好医院呼吸中心,国家呼吸疾病临床研究中心,北京 100029)

慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary emphysema, COPD)是全世界主要的呼吸系统健康问题,通常是由长期吸入有毒颗粒或气体(如香烟烟雾),及宿主因素相互作用所致,其中至少80%病例是由吸入烟草烟雾引发[1],在工业国家甚至可达到95%以上[2]。 尽管COPD 是一种复杂的异质性疾病,主要特征是慢性气道炎症(支气管炎)和/或肺气肿、粘液堵塞、气道感觉神经敏感以及肺功能下降,但其早期症状不显易被忽视,待其发展加重或并发症发生方被识别,加之目前无有效阻止本病诱发或进展的治疗方法,故其致残率和死亡率高,在全球主要死因中位列第三[3]。 目前估计COPD 已影响全球3.28 亿人,在未来20 年内,它将成为主要的死亡原因之一[4],尽管构成了主要的公共卫生问题,但相关研究仍缺乏资金[5]。 COPD 防治当中的许多疾病负担和医疗保健占用都与其合并症和感染病毒或细菌恶化的管理有关[6]。 应用吸入糖皮质激素和支气管扩张药有益于改善COPD患者症状和延缓病情恶化,但临床疗效有限,无法逆转组织病变或改变驱动慢性进展的因素,并且对肺功能下降的影响有限[7]。 加深对COPD 发生和发展的分子途径和反应的理解,将有助于急需的有效治疗药物的开发[8]。 然而,获取COPD 患者全程信息尤为困难,并且多数临床病例通常仅代表疾病过程中特定时间的“快照”[6],故本目标的实现需要建立于动物研究基础之上,亟需建立符合临床实际情况且准确反映疾病病理生理的COPD 动物模型。因此,本文借助数据挖掘方式,对最近10 年涉及COPD 模型建立的文献进行检索并整理分析,以期为COPD 模型的开发所涉及的实验动物的特征选择,造模方法与周期及结局评价等多重建模因素提供参考。

1 材料和方法

1.1 数据来源

以“慢性阻塞性肺疾病”合并“动物模型”为主题词在中国知网、万方数据库中进行搜索,时间为2011 年1 月~2021 年7 月22 日。 收集COPD 动物模型相关研究的文献。 总共523 篇文献,其中知网224 篇,万方299 篇,删除重复后剩余455 篇,通过阅读题目及摘要,筛选出227 篇,再经详细查阅后删除综述类、评论类及重复文献或无法提取数据的文献,剩余176 篇。

1.2 筛选标准

纳入标准:在检索范畴内,选取COPD 动物模型的实验文献,语种不限;排除标准:综述类文献,会议论文和学位论文,重复发表的仅取1 次。 另外,联合的疾病或证型不限,给予药物干预与否不限,少数信息不全(如动物年龄、体重等)的文献亦纳入分析,最终从523 篇文献中纳入176 篇有效文献,包括17 篇英文文献,159 篇中文文献。

1.3 数据处理

实验动物名称、种类等均参照《实验动物和动物实验技术》进行规范,统一处理具有不同名称的动物种类。 将收集的文献中涉及的动物种别、造模方法与周期、检测指标、给药时间、阳性对照药与证候情况等以统一格式录入Microsoft Excel 2013,采取双人录入方法,确保信息的质量控制,并进行整理归纳,建立COPD 动物模型的数据库。

1.4 统计学方法

应用Microsoft Excel 2013 对COPD 动物模型的数据库中的信息进行统计分析,定量或定性归纳造模要素,由于部分信息不全或未进行详细描述,故各项数据的总和可能不等,以具体统计结果为准。

2 结果

2.1 实验动物种别

将176 篇有效文献中应用的实验动物种类及性别进行汇总统计发现,主要包括3 类实验动物,即大鼠、小鼠、小型猪,其中使用最多的是SD 大鼠(83次,47.16%),其次为Wistar 大鼠(59 次,33.52%),C57 小鼠(14 次,7.95%),豚鼠(6 次,3.41%),小型猪(4 次,2.27%),BALB/c 小鼠(3 次,1.70%),其他小鼠包括A/J 小鼠、KM 小鼠、叙利亚金黄仓鼠和金黄地鼠,共5 次(2.84%),未知大鼠(2 次,1.14%);实验动物性别以雄性为主,共140 次,占比79.55%,雌雄各半(雌雄同用)或雌性则较少,分别为24 次和8 次,占比13.64%和4.55%,4 项研究未对性别进行描述,见表1。

表1 慢阻肺模型实验动物种别频数分布Table 1 Types distribution of experimental animals for COPD

2.2 造模周期与方式

在176 篇文献中,共有175 篇文献明确写有造模方法,将其进行分类规范后统计得出,造模方式中应用最多的是烟雾暴露联合脂多糖(91 次,52%),其他>3 次的造模方式主要有4 种,包括单纯烟雾暴露34 次(19.43%),脂多糖6 次(3.43%),烟雾暴露联合肺炎克雷伯杆菌5 次(2.86%),烟雾暴露联合弹性蛋白酶4 次(2.29%),详见表2。

表2 慢阻肺造模方式分类及使用频次Table 2 Classification and frequency of use of COPD models

在应用烟雾暴露的147 篇文献中,48 篇未对烟熏箱进行描述,剩余文献中使用自制烟熏箱84 次(84.85%),使用非自制烟熏箱15 次(15.15%),其中两项应用仅鼻暴露系统[9-10]。

COPD 作为常见慢性病之一,造模周期(model period, MP)较长,可分为30 d 以内、30~60 d、60~90 d、90~120 d、120~150 d、150 d 6 个时间段,统计发现,造模周期多在3 个月内,其中MP≤30 d 最多,共75 次(42.61%),30 d < MP ≤ 60 d 和60 d< MP ≤ 90 d 均为36 次,各占比20.45%,见表3。

表3 慢阻肺模型造模周期Table 3 Modeling cycle of COPD model

2.3 检测指标

将176 篇文献中的全部检测指标进行分类统计,若同一组织被用于检测不同的指标,如肺组织既做病理检测又做免疫组化,则分别进行统计;若同一组织被用于检测多个同类型指标,如肺组织同时检测IL-6、IL-8、TNF-α 等,则把这些指标统一归属于肺组织匀浆指标。 一般状况包括皮毛、食量、活动度、精神状态、舌象、爪色等宏观特征,呼吸系统特征和体重单独计数。 统计结果发现,共有21 种不同类型的指标,累计频数552 次,其中检测较多的依次是肺组织病理(137 次,24.82%)、肺功能(79次,14.31%)、一般状况(63 次,11.41%)、肺泡灌洗液(56 次,10.14%)、血清(46 次,8.33%)、肺组织匀浆(42 次,7.61%)等,详见表4。

表4 慢阻肺模型检测指标分类及使用频次Table 4 Classification and frequency of use of COPD model test indicators

2.4 模型给药时间、阳性对照药及评估指标

将所有文献归纳统计发现,共有89 项研究涉及给药干预,但仅有46 项含有阳性对照药,给药时间选择多为28 d(13 次,28.26%),其次为14 d(8 次,17.39%);阳性对照药的应用方面较为繁杂,共涉及26 不同药物,其中两项研究应用了两种阳性对照药物,分别予以计数,应用最多的阳性对照药是氨茶碱(7 次),其次为地塞米松和固本咳喘片(各4次),见表5。

表5 慢阻肺模型给药时间与阳性对照药情况Table 5 Duration of drug administration and positive control drugs

在使用药物及阳性对照药物的文献中,给药效果的评估指标较多,其中使用频次由多到少排名前五的依次是肺组织病理(28 次,60.87%)、肺组织免疫组 化(26 次, 56.52%)、 一 般 状 况(22 次,47.83%)、肺功能(20 次,43.48%)、血清(19 次,41.30%),见表6。

表6 给药后效果评估指标的分类及使用频次Table 6 Classification and frequency of use of evaluation indexes after administration

2.5 模型证候造模情况

纳入的文献中仅有18 篇涉及证候造模,包括了7 个证型,即肺气虚证、脾虚证、肺脾两虚证、阴虚痰饮证、痰湿/热证、痰瘀阻肺证、寒燥证,以虚证较多,其中造模频次最高的证候是肺气虚证,共8 篇,见图1。

图1 慢阻肺实验动物模型证候造模情况Figure 1 Syndrome modeling of experimental animal model of COPD

3 讨论

COPD 动物模型应是与人类COPD 临床病症特点高吻合度的疾病模型,但目前尚未完全实现。 造模的首要考虑因素为模型动物的选择,动物种类方面涉及鼠类、兔子、猪、狗等[11]。 通过表1 可知,COPD 模型的建立多使用SD 大鼠、Wistar 大鼠和C57 小鼠。 既往研究发现,大鼠体积和肺表面积较大故便于操作,烟雾暴露后易出现纤维化沉积,但其缺点在于与人类的遗传相似性较低,单足体气道结构,粘膜纤毛清除率较高,没有杯状细胞,粘膜腺很少[12-16],大鼠支气管炎症的介导物与人类不同,且对熏烟诱导的肺气肿样损伤的抵抗力较强[17];小鼠具有遗传异质性,对肺损伤可出现多种反应,成本低,种类丰富,但限于专一经鼻呼吸,体积小使肺参数测量困难,粘膜下腺数目少单足体气道分支,难以复制重度COPD[18-21]。 Vlahos 等[22]学者综合了繁殖周期、饲养成本、可操作性与基因信息等因素认为小鼠是最常见选择,研究还发现小鼠性别对烟雾的耐受性差异明显,雌性较雄性小鼠的对烟雾抵抗力差[23],若同一项研究中雌雄同用,造模后肺部损伤程度可能不同,故多数研究仅用雄性小鼠,这与本研究调查结果相一致。

理想的COPD 动物模型应再现人类疾病的主要特征[24],慢支和肺气肿是其最主要特征。 由表2 得知,COPD 最常用的造模方式为烟雾暴露联合脂多糖或单纯烟雾暴露,前者更能模拟人类COPD 急性加重期的病理特点,后者与稳定期基本特点相似[25]。 脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要促炎性糖脂成分,有研究发现它与烟雾暴露联合可引发气道炎症和肺功能的显著改变[26],能较好复制感染引起的COPD 急性发作[27],这与COPD 的主要病因一致,即烟雾和气道感染,而且经鼻吸入脂多糖是一种模拟人类COPD 发育的方法,该方法表现出细菌定植和急性加重[15]。 与单纯烟雾暴露的小鼠相比,应用脂多糖有助于在更短的时间内建立肺气肿特征小鼠模型[28],并更好重现了COPD 的肺部炎症特征,小气道病变和气道重塑更为明显,病理生理改变与人类类似,更加符合本病自然发病过程[29]。 本研究还发现烟雾暴露时多选择自制染毒箱,但其相关参数不明或描述甚少,如箱体体积、通风孔面积,以及烟雾中CO 含量、NO 含量、温度和湿度等;同时,既往研究中对不同实验动物或建模方法的成功率鲜有提及,这些因素影响了模型的稳定性和可重复性,限制了模型规范化的形成。 在造模周期方面,整体上周期偏长,多在3 个月内,以30 d以内居多(表3),部分研究单纯烟雾暴露周期长达6 个月或以上[30-31]。

COPD 模型应具备慢性支气管炎、黏液分泌过多、小气道重塑、肺气肿、肺功能受损等特征,这些特征可从肺功能、肺组织病理、肺泡灌洗液、血清或肺组织匀等指标检测中验证。 临床上1 秒率是人群COPD 确诊的金标准,但其在动物模型评价方面的地位有待进一步深入探究。 虽然目前尚无统一模型判定标准,但几乎所有研究均包括病理形态学指标,因其对气道重塑和肺实质的破坏程度的敏感性比肺功能强[32],其中平均线性截距,破坏指数和凋亡指数尤为重要[33]。 本研究亦发现,肺组织病理是模型评价应用最多的指标,其次为肺功能及动物一般状况(表4),若3 者变化方向趋于一致,且变化情况与COPD 人群吻合度较高,则更能体现模型构建的成功性。

COPD 模型的建立最主要的目的之一即为开发新药,故涉及给药时间和阳性对照药的选择。 从表5 得知,目前研究中给药时间多为28 和14 d,COPD属慢性病,病程较长,故可探索延长给药时间,当然,这与给药剂量相关,因为不同药物对机体发生作用的剂量和致毒效力不同。 严格来讲,需经过药效学实验、急性毒性实验和长期毒性实验来确定给药剂量和时间,但很少有文献述及给药时间确立的缘由,故本结果须慎重解释。 本研究结果提示,阳性对照药之西药多选用氨茶碱、地塞米松,中药则多用固本咳喘片。 在中医证候方面,研究涉及相对较多的是稳定期虚证[34-35],即肺气虚证、脾虚证和肺脾两虚证(图1)。 现有指南中涵盖的证型未能全面复制于动物模型,且病证结合模型的评价指标缺乏特异性和稳定性,不同证候判断方面仅依靠症状,无法实现宏观指标的等效替代,同时缺乏特异性微观指标;再者,缺乏对病证结合模型的干预顺序及稳定性的探究,如先进行证候造模后进行COPD 造模,或二者颠倒,亦或同时进行,目前偏于先病后证,但临床中COPD 患者在疾病形成前往往已有证候存在,因此有必要探索在烟雾暴露前进行证候造模因素的干预,查验证候对COPD 模型建立的影响。 此外,还需考虑模型所处疾病分期,合并症的建立情况及模型死亡率,毕竟现有文献很少报道造模期间的实验动物的死亡率。 临床实践中,COPD 分为急性加重期和稳定期,但在模型评价方面缺乏本病不同时期的特异性指标,尽管部分研究[34,36-38]对此进行初步探索,但尚无定论。 目前造模方式往往难以达到急性期的状态,甚至仅达到稳定期的1、2 级状态[39]。

本文通过对最近10 年COPD 模型相关文献数据分析发现,选用SD/Wistar 大鼠或C57 小鼠作为实验动物,采用烟雾暴露联合脂多糖滴注或单纯烟雾暴露造模,周期在3 个月内,能够有效提升COPD造模的成功率。 模型评价指标建议综合肺组织病理、肺功能、一般状况和肺泡灌洗液等结果。 当然,具体研究时当视研究目的、实验条件等选用不同的造模方法。 总之,结合临床研究获得的知识,单用或联用烟雾暴露的动物模型是寻找COPD 及其不同疾病时期或合并症新疗法的重要工具[6]。 期望通过本文的简要阐述能为COPD 的模型建立和受试药物评价提供一些方法学的参考。