基于生物信息学分析CD93基因在肺鳞癌中的表达及其化疗敏感性和预后的关系

2022-08-16郭荣宋爱萍岳文静高业

中国合理用药探索 2022年7期

郭荣，宋爱萍，岳文静，高业

巴彦淖尔市医院临床药学科，巴彦淖尔 015000

肿瘤是机体正常细胞经过突变积累后，在体内不断增殖和迁移的一种细胞恶变产物。尽管健康机体具有一系列的免疫监视机制，但仍难以阻止肿瘤的发生和发展。少量的肿瘤细胞不易引起机体应答，待肿瘤生长至一定程度，超越了机体免疫应答的能力，肿瘤细胞即可逃逸，导致肿瘤的发生。手术、放疗、化疗是常用的肿瘤治疗方案，但疗效差强人意。

肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤，恢复机体正常的抗肿瘤免疫能力，从而控制与清除肿瘤的治疗方法。这种疗法不仅临床疗效好，而且还避免了对机体的损伤。因此，肿瘤免疫治疗已成为现今肿瘤领域的新希望。肿瘤免疫治疗形式多种多样，如程序性死亡受体-1（programmed death receptor 1，PD-1）免疫检查点抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）受体抑制剂[1]、嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法[2]、肿瘤疫苗[3]等。其中，免疫检查点抑制剂是现今肿瘤免疫治疗的热点。但随着临床应用的深入，研究人员发现只有少数患者可以从免疫检查点抑制剂治疗中获益[4]。因此，寻找新的生物标记物来预测肿瘤免疫治疗的疗效，发现新的靶点来研究新的免疫检查点药物，已成为目前临床研究人员急需解决的问题。

白细胞分化抗原93 （leukocyte differentiation antigen 93，CD93），在许多实体瘤中过表达，阻断CD93能够促进药物递送和免疫治疗效果，提示其可能成为实体瘤治疗的新靶点[5-6]。CD93在细胞内钙通道的激活信号、受体介导的信号转导、淋巴细胞黏附的调节中发挥作用[7]。CD93基因是人类原发性肿瘤血管生成基因中最重要的基因之一，主要表达于肿瘤血管系统，是肿瘤新生血管发生和发展过程中的关键分子。CD93作为一种跨膜糖蛋白，最主要的表达部位是内皮细胞。CD93表达主要限于内皮细胞间连接，并积极参与多种细胞生物过程，包括细胞-基质黏附、细胞迁移、信号转导、干细胞分化、免疫应答和血管生成等。相关文献报道[8-9]提示CD93是一种新型血管生成激活剂，主要通过促进内皮细胞黏附，加速肿瘤血管再生，从而加速肿瘤生长并缩短宿主存活时间。

目前，CD93在肺鳞癌组织中的研究，作者未见相关文献报道。本研究采用生物信息学方法，分析了CD93基因在肺鳞癌组织中的表达情况，同时分析了CD93表达水平与肺鳞癌免疫微环境、化疗敏感性和预后的关系，为肺鳞癌提供新的生物分子标记物。

1 资料与方法

1.1 数据获取

TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/），是由美国国家癌症研究所和国家人类基因组研究所合作建立的癌症研究项目，提供了一个免费的全方位的癌症研究参考数据库，收集整理了癌症相关的数据，涵盖了表观遗传、基因组、转录组、蛋白组等多个组学数据；收录了肺鳞癌的转录组表达数据，包括癌组织和正常组织，Xena（https：//xenabrowser.net）为该数据库提供了标准化数据。本研究探讨了CD93在肺鳞癌组织中表达量的数据，Xena对所用的TCGA数据库中的数据进行了log化处理。

1.2 CD93在肺鳞癌组织中的差异表达

从TCGA数据库下载肺鳞癌转录组数据（包括502个肺鳞癌组织，51个癌旁组织），使用R软件进行基因差异表达分析，比较CD93表达在肺鳞癌组织与癌旁组织中的表达差异。

1.3 基因富集分析

采用基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）探讨CD93参与的肺鳞癌发生发展的相关信号通路；采用加权富集法进行分析，随机组合次数设为1000次，其他参数均按默认值设置。将P<0.05和错误发现率（falsediscovery rate，FDR）<0.05的基因集作为显著富集的基因。

1.4 肺鳞癌组织中CD93表达与肿瘤免疫微环境的关系分析

采用单样本基因集富集分析（ssGSEA）来评估CD93表达与肺鳞癌免疫微环境中24种免疫细胞的相关性。24种免疫细胞分别为：活化树突状细胞（aDC）、B细胞、CD8 T细胞、骨髓来源的抑制性细胞（MDSC）、树突状细胞（DC）、嗜酸性粒细胞、未成熟的树突状细胞（iDC）、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞（NK）、NK-CD56亮细胞、NK-CD56暗细胞、浆细胞样DCs （pDCs）、调节性T细胞、T辅助细胞、中央记忆型T细胞（Tcm）、效应性记忆T细胞（Tem）、滤泡辅助性T细胞（Tfh）、gamma delta T细胞（Tgd）、辅助性T1细胞（Th1）、Th17细胞、Th2细胞和调节性T细胞（Treg）。基于表达谱数据，采用单样本基因集富集分析可以推断这24种免疫细胞的相对丰度。

1.5 CD93表达水平与肺鳞癌预后关系分析

根据CD93 mRNA表达量的中位数，将患者分为高表达组和低表达组，采用Kaplan-Meier法制作生存曲线图。采用log-rank 检验计算两组（以中位数区分）生存差异P值，P<0.05为具有统计学差异。

1.6 CD93表达水平与化疗敏感性分析

根据CD93 mRNA表达量的中位数，将患者分为高表达组和低表达组，采用pRRophetic法预测其对化疗药物的IC50值。

1.7 统计学处理

采用R4.0.1统计学软件对数据进行统计分析。采用t检验比较CD93在肺鳞癌组织和癌旁组织中的表达差异；采用非参数Sperman秩相关分析来计算CD93基因与肺鳞癌组织微环境中免疫细胞的相关性；采用Kaplan-Meier法分析CD93高低表达组之间的生存率差异，P<0.05为具有统计学差异。本研究中，统计分析和作图所用的R包为ggplot2、ggsignif、enrichplot、clusterprofile、gsva、survival。

2 结果

2.1 CD93在肺鳞癌和癌旁组织的表达差异分析

采用R包对CD93在肺鳞癌组织和癌旁组织中的表达差异进行对比分析，结果如图1所示。表达量数据经过log化处理后符合正态分布，经t检验后发现，CD93在癌旁组织中的表达量高于肺鳞癌组织中的表达量，具有统计学差异（P<0.05）。

图1 CD93在肺癌组织和癌旁组织中的表达

2.2 基因富集分析

通过GSEA法分析CD93在免疫反应相关信号通路中的富集水平，结果见图2。

图2 GSEA富集通路

2.3 CD93与肺鳞癌免疫细胞浸润的相关性

通过ssGSEA算法分析CD93表达与肺鳞癌微环境中不同类型免疫细胞的相关性，见图3。其中，横轴表示CD93的表达与免疫细胞的相关性，离中心越远，说明相关性越强；点的大小代表相关性，点越大，相关性越强。由结果可知，CD93表达水平与浆细胞样树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、骨髓来源的抑制性细胞呈正相关，具有统计学差异（P<0.05）。

图3 CD93的表达与肺鳞癌组织免疫细胞浸润的相关性

2.4 CD93表达与肺鳞癌患者预后的关系

采用Kaplan-Meier法分析CD93高表达组和低表达组总体生存率的差异，结果见图4。发现高表达CD93组中肺鳞癌患者的总体生存率高于低表达组，具有统计学差异（P<0.05）。这一现象与CD93在肺癌组织和正常组织之间的差异表达结果趋于一致。

图4 CD93的表达与肺鳞癌患者预后的关系

2.5 CD93与肿瘤药物的敏感性

利用pRRophetic算法[10]，使用GDSC（the Genomics of Drug Sensitivity in Cancer）数据库预测肺鳞癌组织CD93表达水平对化疗药物IC50值的影响，见图5。结果发现对于紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛、顺铂等化疗药物，在CD93低表达的肺鳞癌组织中IC50值较低，显示其对相关化疗药物敏感。

图5 CD93表达与化疗药物的敏感性预测

3 讨论

肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率居癌症之首。肺癌分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），而非小细胞肺癌约占肺癌的80%～85%，其中肺鳞癌约占非小细胞肺癌的15%～20%。相对于肺腺癌，肺鳞癌的靶向药物相对较少[11]，化疗的可选择性较少，因此患者生存率差强人意。随着肿瘤免疫治疗的到来，肺鳞癌免疫基因组学分型及预测模型构建，为肺鳞癌患者带来新的希望[12]。

本研究采用生物信息学方法，研究了CD93基因在肺鳞癌组织和正常组织中的表达差异。相对于正常组织CD93在肺鳞癌组织中是低表达的，这与其他基因的表达情况一致[13]。由于CD93基因主要参与内皮细胞的增殖、迁移和新生血管的生成，是人类原发性肿瘤血管生成基因标记中的高突变基因之一[5]。因此，相对于正常组织，CD93低表达的可能原因是CD93基因在肺鳞癌组织中产生了突变。对于CD93基因突变和表达量之间的关系情况，本研究将继续研究与探讨。

肿瘤的免疫治疗是当前肿瘤治疗领域的研究热点。随着研究的深入，对于肿瘤微环境、发现有意义的肿瘤免疫靶点一直是肿瘤免疫治疗的研究热点。相关研究显示[5]，阻断CD93信号通路可增加肿瘤内效应T细胞的数量，增强抗肿瘤免疫反应。本研究中GSEA分析表明CD93基因对于免疫信号通路如干扰素α反应、干扰素γ反应，在CD93高表达组中均有富集。同时，通过分析CD93mRNA在肺鳞癌组织中的表达，发现CD93与大多数免疫浸润淋巴细胞密切相关，特别是浆细胞样树突状细胞和调节性T细胞。浆细胞样树突状细胞和调节性T细胞在肿瘤免疫逃逸中扮演重要的角色，因此，我们推测CD93的表达可能与肺鳞癌的免疫抑制微环境有一定的相关性。

本研究预后分析发现，CD93低表达的患者预后反而劣于高表达CD93的患者，分析其可能原因：①CD93基因可能发生了一定程度的突变，影响了CD93的表达。② 本研究证实CD93激活了一些免疫通路，这些激活的免疫通路可能使肺鳞癌肿瘤微环境发生了一定的动态变化，间接导致肿瘤细胞的凋亡，从而延长了患者的生命周期。而CD93激活了哪些免疫通路，引起了肿瘤微环境的动态变化，有待进一步研究证实。

目前，传统的细胞毒性药物是肺鳞癌的常见治疗药物[14]。本研究尝试预测不同CD93表达水平的肺鳞癌亚型对化疗药物的敏感性，结果发现对于长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛、顺铂，其高表达CD93水平IC50值高于低表达CD93水平，说明CD93高表达水平对化疗可能不敏感。

本研究不足之处在于因GDSC数据库收集了传统化疗药物，而对于靶向药物、免疫检查点药物没有进行收录。因此，本研究尚不能对当前肺鳞癌治疗的靶向药物和免疫药物进行预测。相信随着研究的进步和大数据的普及，未来可以实现这一目标。

本研究证实了CD93在肺鳞癌预后中的重要作用，同时证实了CD93基因低表达与患者预后有一定的相关性，CD93的表达与肺鳞癌免疫细胞浸润水平密切相关，并可调控相关的免疫信号通路。在未来的研究中，我们将进一步探索CD93在肺鳞癌细胞中的功能，并对其分子机制进行深入探讨。

合理用药科普

肺鳞癌的典型症状

（一）发热

首发症状者占20%～30%。肺鳞癌所致的发热原因有2种：①炎性发热，多在38℃左右，很少有超过39℃的情况。抗菌药物治疗可能有一定治疗效果，但因分泌物引流不畅，常反复发作。②癌性发热，多由肿瘤坏死组织被机体吸收所致，此种发热抗炎药物治疗无效，激素类或吲哚类药物有一定的临床疗效。

（二）咳嗽

咳嗽是最常见的症状，以咳嗽为首发症状者占35%～75%。肺鳞癌所致的咳嗽可能与支气管黏液分泌的改变、阻塞性肺炎、胸膜侵犯、肺不张及其他胸内合并症有关。对于吸烟或患慢性支气管炎的患者，尤其是老年人，如出现咳嗽程度加重，次数变频；咳嗽性质改变如呈高音调金属音时，要高度警惕癌变的可能性。

（三）痰中带血或咯血

痰中带血或咯血亦是肺癌的常见症状，以此为首发症状者约占30%。由于肿瘤组织血供丰富、质地脆，剧咳时血管破裂而致出血，咳血亦可能由肿瘤局部坏死或血管炎引起。咳血的特征为间断性或持续性、反复少量的痰中带血丝，或少量咯血，偶因较大血管破裂、大的空洞形成或肿瘤破溃入支气管与肺血管而导致难以控制的大咯血。

（四）胸痛