不同剂量依达拉奉对防治七氟醚诱导术后认知功能障碍的研究

黄钰媛，韦雪梅，郑育秀，刘丽丽 (海南医学院第二附属医院麻醉科,海南 海口 570311)

随着医疗技术的进步，越来越多老龄患者倾向于手术治疗各种疾病。但部分老龄患者因存在慢性病与器官功能衰退，全麻手术常导致各种并发症。其中，术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是老龄患者全麻手术后常见的并发症，显著延长了患者住院时间，影响了患者生活质量，增加了患者治疗费用与病死率[1]。因此，如何防治POCD具有重大意义。已有研究证实，氧化应激与神经炎症在POCD病程进展中起重要作用[2]。在老龄大鼠海马中，全麻后腹部手术造成氧化因子水平升高，Toll样受体4/核因子κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor κB,TLR4/NF-κB)信号通路活化，炎性细胞因子释放增加，进而出现短暂的POCD[3]。因此，如何降低全麻术后氧化应激反应与神经炎症反应是POCD治疗的关键。

依达拉奉(Edaravone)是一种强大的自由基清除剂。临床上，依达拉奉主要用于治疗缺血性中风。有研究报道，依达拉奉为3 mg·kg-1剂量时可以改善缺血性脑卒中大鼠的神经功能损伤[4]；另一项研究显示，3 mg·kg-1依达拉奉可改善脂多糖诱导的神经炎症[5]，这提示依达拉奉可能对POCD的治疗有益。然而，临床上即使依达拉奉剂量达到0.5 mg·kg-1(对应小鼠应用剂量约为6 mg·kg-1)，对POCD的治疗效果仍不理想[6-7]。如刘鹏飞等[8]在腹腔热灌注化疗研究中，60例未使用依达拉奉的患者仅有16例出现了POCD症状，而对应的60例使用0.5 mg·kg-1依达拉奉治疗的患者仍有10例出现了POCD症状。因此，0.5 mg·kg-1依达拉奉对POCD的防治难以获得满意结果，提高依达拉奉剂量用于POCD的防治是必要的。本研究拟采用先前报道的多次麻醉/手术的方式构建POCD模型[9-10]，探究高浓度依达拉奉对POCD的防治作用，以期为依达拉奉的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

48只雄性Balb/c小鼠，SPF级，14月龄ICR小鼠，体质量30～40 g，由海南医学院动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK(琼)2020-0007，动物使用许可证号：SYXK(琼)2022-0013。饲养环境为12 h/12 h昼夜循环，湿度(50±10)%，温度20～24 ℃，每笼4只。本实验中所有操作均按照美国国立卫生研究院颁布的《实验动物的护理和使用指南》规定执行。

1.2 实验方案

参考文献中POCD模型构建方案[9-10]，采取多次麻醉，辅以开腹手术模拟临床上多次全麻手术过程构建。具体操作流程：将小鼠随机分为对照组(Con组)、七氟醚组(Sev组)、七氟醚+依达拉奉低剂量组(Sev+Eda-L组,6 mg·kg-1)、七氟醚+依达拉奉高剂量组(Sev+Eda-H组,12 mg·kg-1)。POCD模型构建前，所有小鼠禁食6 h。Con组小鼠吸入空气—氧气混合气体。除Con组外，将其余各组小鼠置于麻醉箱中，通入3%七氟醚(厦门慧嘉生物公司，PPSJ-099064)和30%空气—氧气的混合气体，设置氧气流量为 3 L·min-1。待小鼠完全麻醉后，从麻醉箱中取出小鼠，腹部消毒后剪开约2 cm的小口，游离出部分小肠再放回，缝合小鼠腹部，再将小鼠放入麻醉箱中。整个通气过程维持3 h以模拟较长时间的手术操作。所有小鼠麻醉过程中使用气体检测仪监测麻醉箱中七氟醚浓度及CO2浓度，避免小鼠因麻醉过量或窒息死亡。每间隔1周，对七氟醚各组小鼠使用七氟醚吸入麻醉，麻醉条件与第1次相同，但不进行开腹手术以避免后续水迷宫实验中出现伤口感染，麻醉操作共3次。每次麻醉结束后，依达拉奉组小鼠持续尾静脉注射不同剂量依达拉奉稀释液(南京先声东元制药有限公司，H20031342)，Con组与Sev组注射生理盐水。

1.3 Morris水迷宫实验

待小鼠第3次麻醉结束，次日清醒后开展水迷宫实验。Morris水迷宫(赛昂斯，江苏，型号：SA201)是用来测试突触记忆的实验方法。水迷宫是一个直径为110 cm的圆形水池，整个水迷宫分为4个象限，逃生平台位于第Ⅰ象限中央，水迷宫中注入深约40 cm的温水以覆盖逃生平台。水迷宫顶端设置1个相机，连接电脑，用于记录小鼠游泳轨迹。所有小鼠开展4 d的训练以帮助识别并定位逃生平台，具体内容是将小鼠自各个象限丢入水中，记录小鼠登上逃生平台的时间，记为逃避潜伏期。训练结束后，撤去逃生平台，检测小鼠突触记忆。具体内容是将小鼠自第Ⅲ象限丢入水中，记录小鼠游泳速度、在第Ⅰ象限中停留的时间以及到达逃生平台的时间。

1.4 ELISA检测炎性细胞因子水平

选购TNF-α(70-EK282/3-96)、IL-1β(70-EK201B/3-96)与IL-6(70-EK206/3-96)的ELISA试剂盒(杭州联科生物公司)。待行为学测试结束，小鼠以CO2安乐死，取新鲜脑组织，镊取出海马区样本，加入PBS并匀浆。超声处理10 min，将匀浆液在4 °C下以2 000 r/min离心15 min，取上清液。将样品分别加入试剂盒检测孔板中，37 ℃孵育2 h。PBST清洗，加入检测抗体，37 ℃孵育1 h。PBST清洗，加入链霉素-HRP工作液，37 ℃孵育30 min。PBST清洗，加入TMB底物显色5 min左右，加入终止液。在450 nm波长处使用酶标仪检测OD值，绘制标准曲线，计算各个样本中IL-6、IL-1β与TNF-α的含量。

1.5 氧化因子水平检测

选择南京建成生物公司的超氧歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性检测试剂盒(A001-3-2)。将待测样本与试剂盒中酶工作液、酶稀释液和底物应用液混合，37 ℃孵育20 min。450 nm处读取酶标仪数值，根据对照孔数值获得SOD活力，将SOD活力与样本中蛋白含量相比得到结果。

选择南京建成生物公司的丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)含量检测试剂盒(A003-1-2)。将待测样本、稀释后的标准品与试剂盒中不同试剂混合，95 ℃水浴40 min。以3 000 r/min离心10 min后取上清，在532 nm处、1 cm光径条件下测试各管吸光度值。根据标准品吸光度值/浓度曲线计算样本中MDA含量，将MDA含量与样本中蛋白含量相比得到结果。

1.6 免疫荧光检测Iba1表达

小鼠心脏灌流后，取脑组织，置于4%多聚甲醛中固定。将脑组织放入梯度蔗糖溶液中脱水，加入冷冻包埋液，冷冻后切成约30 μm厚的冠状切片。取切片放入含0.01%Triton X-100的PBST中洗涤，室温下用3%羊血清白蛋白封闭30 min。PBST洗净切片上的血清，将切片放入兔源单克隆anti-rat Iba1(1∶100,美国abcam公司,ab178847)中，4 ℃孵育过夜。次日取出切片，PBST洗净一抗稀释液后，浸入Goat anti-rabbit Alexa 594 IgG(H+L)抗体(1∶500,美国Abcam公司,ab150080)中，室温下孵育2 h。再以DAPI染液染色15 min，滴加抗荧光猝灭剂，在荧光显微镜下拍摄海马区Iba1表达。

1.7 Western blot检测TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达

取小鼠海马组织，称重后加入含有1% PMSF的RIPA裂解液(上海碧云天生物公司，P0013)，4 ℃匀浆形成细胞悬液，静置裂解30 min。将总裂解物在4 ℃下以12 000 r/min离心30 min。取离心后上清液通过BCA蛋白定量试剂盒(P0012S，上海碧云天生物)测定蛋白浓度。在上清液中加入上样缓冲液(上海碧云天生物公司，P0280)，通过SDS-PAGE分离等量的样品(20 μg蛋白)。设置电泳时间30 V/30 min，90 V/90 min，以上样缓冲液到达底端为终点。湿法转膜将凝胶上蛋白转移至PVDF膜(美国Thermo公司，88585)上，设置转膜时间2 mA/60 min，全程冰浴。使用不同一抗孵育过夜：兔多克隆抗NF-κB和抗p-NF-κB抗体(1∶1 000，北京博奥森生物公司，bs-34045R，bs-3543R)，兔多克隆抗TLR4抗体(1∶1 000，北京博奥森生物公司，bs-20379R)，兔多克隆抗NLRP3抗体(1∶1 000，北京博奥森生物公司，bs-23722R)和兔多克隆抗β-actin抗体(1∶3 000，北京博奥森生物公司，bs-0061R)。使用对应羊抗鼠/兔IgG(H+L)二抗稀释液(1∶5 000，武汉三鹰生物公司，SA00001-1、SA00001-2)孵育。取出PVDF膜，PBST洗涤3次，膜上滴加ECL发光液(南京天能生物公司，180-501，180-5001)，显影仪(南京天能生物，型号：1600/1600R)下显影并使用Image J软件分析。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 依达拉奉对七氟醚诱导小鼠认知功能的影响

训练期间，各组小鼠逃避潜伏期都出现一定程度缩短。与Con组相比，Sev组小鼠第2～4天逃避潜伏期显著较长(P<0.05)，Sev+Eda-L组小鼠第3～4天逃避潜伏期显著较长(P<0.05)。与Sev组相比，Sev+Eda-H组小鼠第3～4天逃避潜伏期显著较短(P<0.05)。与Sev+Eda-L组相比，Sev+Eda-H组小鼠第4天逃避潜伏期显著较短(P<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠水迷宫训练期间逃避潜伏期

测试期间，各组小鼠在游泳速率没有差异的情况下，与Con组相比，Sev组、Sev+Eda-L组小鼠首次到达平台时间显著较长(P<0.05)，穿越平台次数、第Ⅰ象限停留时间显著较少/短(P<0.05)。与Sev组相比，Sev+Eda-H组小鼠首次到达平台时间显著较短(P<0.05)，穿越平台次数、第Ⅰ象限停留时间显著较多/长(P<0.05)。与Sev+Eda-L组相比，Sev+Eda-H组小鼠首次到达平台时间显著较短(P<0.05)，第Ⅰ象限停留时间显著较长(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠水迷宫测试期间突触记忆功能指标

2.2 依达拉奉对七氟醚诱导小鼠海马中氧化应激水平的影响

与Con组相比，Sev组和Sev+Eda-L组小鼠海马中SOD活力显著降低(P<0.05)，MDA水平显著升高(P<0.05)。与Sev组和Sev+Eda-L组相比，Sev+Eda-H组小鼠海马中SOD活力显著增加(P<0.05)，MDA水平显著降低(P<0.05)，见表3。

表3 各组小鼠海马中SOD活力与MDA水平

2.3 依达拉奉对七氟醚诱导小鼠海马中Iba1表达的影响

与Con组相比，Sev组、Sev+Eda-L组小鼠海马中Iba1表达显著增加(P<0.05)；与Sev组相比，Sev+Eda-H组小鼠海马中Iba1表达显著降低(P<0.05)，见图1、2。

2.4 依达拉奉对七氟醚诱导小鼠海马中TLR4/NF-κB信号通路的影响

与Con组相比，Sev组小鼠海马中TLR4、p-NF-κB、NLRP3表达水平显著升高(P<0.05),Sev+Eda-L组TLR4、p-NF-κB表达水平显著升高(P<0.05);与Sev组和Sev+Eda-L相比，Sev+Eda-H组小鼠海马中TLR4、p-NF-κB、NLRP3表达水平显著降低(P<0.05)，见图3。

2.5 依达拉奉对七氟醚诱导小鼠海马中炎性细胞因子水平的影响

与Con组相比，Sev组、Sev+Eda-L组小鼠海马中IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著升高(P<0.05)。与Sev组和Sev+Eda-L组相比，Sev+Eda-H组小鼠海马中IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著降低(P<0.05)，见表4。

3 讨论

本研究采用多次麻醉/手术的方法构建了老龄小鼠POCD模型，并通过Morris水迷宫实验判断模型构建是否成功。临床前研究中，Morris水迷宫实验是探究啮齿类动物突触学习与记忆能力的常用方法[11]。其中，训练期间逃避潜伏期的变化可以反映小鼠的学习能力，测试期间的穿越平台次数与逃生平台象限停留时间可以反映小鼠的空间记忆能力。本研究结果显示，Sev组小鼠逃避潜伏期较长，且穿越平台次数与平台象限停留时间较少/短，提示Sev组小鼠学习与记忆功能损伤，即老龄小鼠POCD模型构建成功。临床上治疗缺血性脑卒中常用的依达拉奉剂量为30～60 mg·d-1，即为0.5～1.0 mg·kg-1·d-1[12]，由于小鼠与人体表面积换算约为12.3，故小鼠尾静脉给药剂量为6～12 mg·kg-1·d-1。然而本研究中，Morris行为学结果显示，6 mg·kg-1依达拉奉对小鼠学习与记忆能力改善并不明显，当依达拉奉剂量达到12 mg·kg-1时，小鼠学习与记忆能力得到显著改善。因此，临床治疗中依达拉奉剂量上调后才能发挥其对POCD的防治作用。

正常生理条件下，细胞呼吸会生成高反应活性的氧自由基，大量的活性氧自由基会作用于脂质发生过氧化反应，产生具有生物毒性的MDA，造成细胞膜、线粒体、溶酶体等细胞器结构被破坏[13]。七氟醚全麻手术可诱发氧自由基释放增加，诱导氧化应激。此外，七氟醚刺激会干扰正常生理调节机制，抑制抗氧化酶活性，破坏抗氧化系统。本研究结果显示，Sev组小鼠脑中氧化指标MDA水平升高，而抗氧化指标SOD活性降低，提示氧化应激的发生。依达拉奉作为一种高效的自由基清除剂，可经血液穿过血脑屏障，清除脑内氧自由基，抑制脂质过氧化[14]。本研究结果显示，虽然与Sev组相比，Sev+Eda-L组MDA水平与SOD活力没有明显变化，提示临床等效剂量6 mg·kg-1依达拉奉对七氟醚诱导的氧化应激反应没有明显影响。只有当依达拉奉剂量达到12 mg·kg-1时，MDA水平与SOD活力恢复至基值，提示临床中应用60 mg·d-1剂量的依达拉奉治疗成人术后POCD能够明显改善认知功能。

有研究报道，POCD中氧化应激反应往往伴随着过度激活的炎症反应[15]。氧自由基是炎症反应的效应因子，小胶质细胞过度活化是氧化应激反应的结果，其特征是Iba1急剧增加[16]。因此，针对氧化应激反应的治疗能够减轻炎症反应。TLR4是位于小胶质细胞表面的模式识别受体，在氧化应激中活化并激活下游多种信号通路，导致NF-κB转移至细胞核内，从而促进其他炎性细胞因子释放，作用于中枢神经系统，导致认知功能障碍[17]。本研究中，6 mg·kg-1依达拉奉对Iba1表达没有显著影响，对TLR4/NF-κB信号通路和海马中IL-6、IL-1β及TNF-α含量也没有显著影响；然而，12 mg·kg-1依达拉奉治疗后，POCD小鼠海马中Iba1表达明显减少，TLR4/NF-κB信号通路明显受到抑制，且IL-6、IL-1β与TNF-α含量明显降低。该结果提示，依达拉奉对POCD小鼠海马中炎症反应的抑制作用存在剂量依赖性。

综上所述，因为6 mg·kg-1依达拉奉的抗氧化作用并不显著，无法改善多次麻醉/手术造成的小鼠脑中炎性细胞因子释放，对小鼠学习与记忆能力改善并不显著。所以，临床上0.5 mg·kg-1依达拉奉防治全麻手术患者POCD存在一定的局限性。同时本研究显示，对全麻手术患者POCD的防治作用可以通过上调依达拉奉剂量实现，在12 mg·kg-1依达拉奉的治疗中，POCD小鼠氧化应激反应受到明显抑制，炎症反应明显减轻，小鼠学习记忆能力明显改善。然而，由于依达拉奉给药多为静脉注射，因此针对依达拉奉剂量梯度上调的安全性探索仍待继续。