海洋致病菌致病机制及其感染的治疗研究进展

赵语佳，王绍乙，李裕晴，李洁

海军军医大学基础医学院医学遗传学教研室，上海 200433

海洋致病菌多为广泛分布于海洋的革兰氏阴性菌，是造成渔民及海军士兵开放性伤口继发性感染、沿海居民食用海产品发生食物中毒的主要致病菌，如治疗不及时病死率较高。随着我国水产养殖业蓬勃发展，且常用抗生素耐药率逐年增加，海洋致病菌感染率逐渐升高，深入了解海洋致病菌致病机制以探究海洋致病菌感染治疗方法义不容缓。海洋致病菌主要有弧菌属的创伤弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌及铜绿假单胞菌等，海洋致病菌致病机制主要集中在粘附相关蛋白、细胞毒性、宿主防御、摄铁系统、分泌系统、毒力调控等方面。现就海洋致病菌的致病机制及其感染的治疗研究进展情况综述如下。

1 创伤弧菌的分布分型、致病机制及感染治疗方法

1.1 分布分型 创伤弧菌的分布与海水温度、含盐量有关，受温度影响，最适繁殖温度在20～30 ℃，13 ℃以下停止繁殖进入休眠期，故其多分布于澳洲、东南亚等亚热带及热带地区。受含盐量影响，最适于在含盐量为10%～18%的环境下生存，由于海水盐度一般为35%，故创伤弧菌主要分布于河海交界处。根据创伤弧菌的生物学特性将其分为三型，Ⅰ型主要以人类为感染对象，Ⅱ型主要以鳗鱼为感染对象，Ⅲ型兼具Ⅰ、Ⅱ型特征。从水产品样本中分离细菌，用TCBS 等显色培养基培养，菌落呈绿色、光滑、整齐、微凸状。采用定性PCR 法对分离培养后得到的细菌进行基因分型鉴定，检测分析创伤弧菌的创伤弧菌溶血素A（vvhA）基因、毒力相关基因C/E、和16S rRNA A/B 等。

1.2 致病机制 创伤弧菌可引起呕吐、发热、休克、腹泻等感染症状，开放性伤口接触海水，受到创伤弧菌污染可导致皮肤和软组织感染。严重者出现败血症、严重蜂窝组织炎和坏死性筋膜炎等症状。患有慢性肝病、糖尿病、血色素沉着症和重型地中海贫血等疾病的患者，更有可能发生危及生命的感染形式。创伤弧菌为革兰氏阴性菌，其致病机制的相关研究主要集中在黏附相关蛋白、细胞毒性、宿主防御、摄铁系统、分泌系统和毒力调控等方面。

1.2.1 黏附相关蛋白 创伤弧菌主要的黏附相关蛋白为黏附素和外膜蛋白。黏附素是由tad基因编码的Ⅳ型菌毛和由flaA、flaB、fdaC、flaD、flaE、flaF编码的鞭毛，与细菌的运动、黏附、侵袭、致病性有关。YAMAZAKI 等［1］发现，rFlaB 免疫小鼠细胞可通过降低创伤弧菌运动性来抑制对肌肉组织的侵袭，证实了黏附素的致病作用，提示黏附素相关基因可作为创伤弧菌感染治疗靶点选择。创伤弧菌的主要外膜蛋白（omp）为OmpU，还可分泌IlpA 重组脂蛋白，具有黏附作用。据LEE 等［2］研究，IlpA激活Toll 样受体2 可触发单核细胞中细胞因子的产生，加重炎症反应。综上创伤弧菌可通过黏附相关蛋白黏附于组织表面侵入细胞，并造成一定毒性作用，侵入细胞后通过其他致病机制继续破坏机体细胞正常生命结构。

1.2.2 细胞毒性 创伤弧菌分泌创伤弧菌溶细胞素（VVC）、金属蛋白酶（VVP）、重复序列毒素A（RtxA）、多功能自动处理重复毒素（MARTX）和磷脂酶A2（PlpA2）等，造成对细胞的毒性作用。VVC由vvhA编码，通过Ⅱ型分泌系统（T2SS）分泌到胞外，是惟一可分泌至胞外的外毒素。据QIN 等报道，VVC 显著上调了促炎细胞因子IL-6 和炎症趋化因子MCP-1、IP-10 mRNA 表达，可选择VVC 作为创伤弧菌诱导的炎症反应治疗靶点［3］。VVP 由vvp/vvpE基因编码，具有溶血性与细胞毒性，可消化宿主蛋白增加血管通透性，有利于创伤弧菌渗入肠壁或侵入腹腔引发组织坏死。创伤弧菌RtxA 有三种，即RtxA1、RtxA2、RtxA3，仅RtxA1 存在毒性，由rtxA1基因编码。LEE 等报道，RtxA 可诱导创伤弧菌感染的树突状细胞分泌IL-1β 和IL-6，并可诱导增加小肠固有层中Th17 细胞，激发宿主对创伤弧菌感染的适应性免疫［4］。MARTX广泛存在于霍乱弧菌、创伤弧菌等细菌中，CHEN 等实验证明MARTX可导致巨噬细胞中相关信号因子失活，使创伤弧菌逃脱巨噬细胞的吞噬作用［5］。PlpA 可与MARTX 协同作用，合作诱导细胞浸润以实现坏死细胞快速死亡［6］。

1.2.3 宿主防御 创伤弧菌通过分泌荚膜多糖（CPS）和酸中和机制进行宿主防御。CPS 是生物膜主要成分，可逃避补体识别与吞噬细胞的吞噬，增强创伤弧菌耐干燥、抗宿主免疫的能力。创伤弧菌的酸中和机制使其可在高酸性的胃环境存活，在酸性环境下细胞分泌超氧化物增多，超氧化物暴露增加了创伤弧菌赖氨酸脱羧酶活性，使其分解赖氨酸形成可清除超氧化物自由基的酸中性抑制剂尸胺，在宿主体内形成酸性防御［7］。

1.2.4 摄铁系统 创伤弧菌的摄铁系统是创伤弧菌与铁配合物和铁结合蛋白竞争铁的机制。据MIYAMOTO 等［8］报道，创伤弧菌通过血红素获取系统游离血红素中的铁，也可通过分泌对铁高亲和力的铁载体夺取铁。铁—铁载体周质结合蛋白和铁螯合还原酶可作为诊断创伤弧菌感染的指标之一，也可作为药物治疗候选靶点。

1.2.5 分泌系统 细菌分泌系统通过分泌相关因子，使蛋白质跨膜转运。目前关于创伤弧菌细菌分泌系统的研究较少，Ⅰ型分泌系统（T1SS）主要分泌毒素RtxA，是肠道发病机制和全身传播所必需的，T2SS 是VVC 的分泌所必需的，与肠道发病机制相关。

1.2.6 毒力调控 创伤弧菌通过群体感应系统（QS）、总体毒力调节因子和VVH 进行毒力调控。不同革兰氏阴性菌QS 机制不同，但调控蛋白具高度同源性，大多以脂肪酰基高丝氨酸内酯（AHL）为自诱剂，共同具有LuxI-AHL 型QS。创伤弧菌特有LuxS/LuxR 型QS，可调节CPS、菌毛的合成，SmcR是细菌QS 的主要调节因子。据Kim 等报道，抑制SmcR 活性的小分子可抑制创伤弧菌生物膜的扩散，从而抑制对宿主的致病性，可猜测创伤弧菌QS与其在宿主生物膜中的分离有一定关系［9］。创伤弧菌总体毒力调节因子有cAMP-cAMP 受体蛋白（CRP）和毒力调节因子AphB，CRP 可影响编码VVC、VVP 等基因的表达，阻遏代谢，AphB 可调控吸收和代谢相关基因，控制细胞生长。KIM 等［10］发现，AphB 可抑制人肠上皮细胞中促炎细胞因子IL-8的产生，使机体炎症反应增强。VVH 通过与细胞膜结合形成孔隙并激活宿主炎症反应，具有强大的溶血性和细胞溶解活性，并有助于细菌从肠道侵入血液。

1.3 感染治疗方法 创伤弧菌感染起病急骤、病情凶险。临床研究表明，早期感染需强有力的抗菌药物治疗，必要时清创和截肢。有研究表明，创伤弧菌对多种抗菌药物比较敏感，可使用第三代头孢菌素如头孢噻肟、四环素类如米诺环素和喹诺酮类抗菌药物，严重感染应联合应用上述药物。目前，针对创伤弧菌研发的新药有DIDS，一种经典的氯通道抑制剂，显著降低了创伤弧菌RtxA1 诱导的细胞毒性［11］。对于伤口感染需进行创面清创、坏死筋膜炎切开减张术甚至截肢等早期手术处理。且根据最新临床研究，早期血浆置换对创伤弧菌脓毒症有帮助［12］。

2 副溶血性弧菌的分布分型、致病机制及感染治疗方法

2.1 分布分型 副溶血性弧菌广泛分布于沿海、海洋和河口环境，在亚洲、欧洲、美洲国家均有分布，较少分布于炎热、干旱的非洲国家。副溶血性弧菌分布浓度与季节相关，通常在温度较高的夏季浓度高，但其生长繁殖及分布浓度与温度的相关性较复杂，还需考虑地理位置不同带来的气候、湿度等差异。副溶血性弧菌的分型鉴定主要采用PCR 法依据其特异性的不耐热溶血素（TLH）编码基因，及其致病基因—耐热性溶血素（TDH）编码基因和耐热性溶血素相关毒素（TRH）编码基因进行基因分型鉴定［13］。

2.2 致病机制 副溶血性弧菌可引起以水样腹泻和腹部阵发性绞痛为主要症状的急性肠胃炎；对免疫低下者可引起脓毒症；也可因为其他组织病变，如大疱性皮肤病、类风湿关节炎和反应性关节炎。副溶血性弧菌致病机制的相关研究主要集中在黏附相关蛋白、细胞毒性、宿主防御、分泌系统等方面。

2.2.1 黏附相关蛋白 副溶血性弧菌的黏附相关蛋白为血凝素、烯醇化酶等黏附因子。

2.2.2 细胞毒性 副溶血性弧菌分泌溶血素、蛋白酶、尿素酶和脂多糖（LPS）等产生对细胞的毒力作用。副溶血性弧菌溶血素按照耐热程度分为TDH、TRH、TLH，分别由tdh、trh、tlh基因编码。ZHANG 等［14］发现，tdh2的转录抑制因子CalR 可抑制副溶血性弧菌的溶血功能，为治疗提供新的靶点。副溶血性弧菌发挥毒力作用的蛋白酶主要为金属蛋白酶（VPP）和丝氨酸蛋白酶，VPP 与VVP功能相似但其具体调控机制仍不明确。丝氨酸蛋白酶切割蛋白质中肽键使蛋白质失活，主要种类为VPP1/蛋白酶A、VpSP37、PrtA。副溶血性弧菌尿素酶可催化尿素水解生成氨与二氧化碳。据CAI 等早期实验，分离的副溶血性弧菌的尿素酶可引起肠液积聚，并在乳鼠实验中呈阳性证实尿素酶的毒力作用［15］。BANDEKAR 等［16］发现，副溶血性弧菌LPS 可激活小鼠腹腔巨噬细胞的活性，激发炎症反应。

2.2.3 宿主防御 副溶血性弧菌通过细胞壁主要成分Omp 进行宿主防御，Omp 在菌体自身的稳定性和物质运输过程中起着关键作用。脂多糖运输蛋白D（LptD）是一种必需Omp，ZHA 等［17］将小鼠接种LptD 疫苗，产生了对于副溶血性弧菌100%的免疫保护，提示LptD 可作为疫苗抗原和免疫靶点选择。

2.2.4 分泌系统 副溶血性弧菌的细菌分泌系统主要由Ⅲ型分泌系统（T3SS）发挥作用，分别有T3SS1，T3SS2 两套T3SS，T3SS1 可诱导细胞毒性，其相关调节因子Cadc 蛋白和毒力表达调控（toxR）蛋白可提供相关治疗靶点，T3SS2 与引起急性胃肠炎有关。

2.3 感染治疗方法 副溶血性弧菌感染轻症不需治疗，但患者需补充大量液体以补充因腹泻而流失的水分。发高烧或有潜在疾病的患者应口服多西环素或喹诺酮类抗生素治疗，也可联合用药。轻度伤口感染和菌血症通常不需治疗，因为副溶血性弧菌感染具有自限性。对于严重的伤口感染或脓毒症，可使用强力霉素和第三代头孢菌素，坏死性筋膜炎患者则需手术清创。副溶血性弧菌和铜绿假单胞菌有类似的耐药机制，但具体机制仍需进一步研究。副溶血性弧菌感染的新药研究方向主要在抑制鞭毛生物合成、生物膜形成、Ⅲ型效应因子分泌和相关基因的转录，以及参与群体感应和毒素产生调节的基因的转录等方面。柠檬醛、抗菌肽、纳米银、噬菌体等在治疗副溶血性弧菌感染上有前景［18-21］。

3 霍乱弧菌的分布分型、致病机制及感染治疗方法

3.1 分布分型 霍乱弧菌广泛分布于非洲、美洲、亚洲、中东等全球多个国家及地区，其数量增减与季节相关，5、6 月因气温升高和降水量增多，霍乱弧菌繁殖增多。自然灾害的发生也可使霍乱弧菌分布发生变化，在飓风、海啸、地震、泥石流等自然灾害侵袭的地区易发生较大规模的霍乱爆发。霍乱弧菌中主要致病菌为o1血清群及o139血清群，采用玻片凝集试验区分此两种血清型霍乱弧菌，不同血清型的霍乱弧菌可与o1、o139 诊断血清分别产生凝集现象。此外，基于PCR 法的基因分型鉴定应用较为广泛，主要以霍乱弧菌的毒素基因霍乱毒素基因、毒力协同调节菌毛基因、o 抗原基因、外膜蛋白基因、toxR基因等作为检测靶基因［22］。

3.2 致病机制 霍乱弧菌可引起以急性腹泻为主要症状的肠道传染病—霍乱，临床表现为上吐下泻、排泄物呈“米泔水样”且含大量弧菌，如不及时治疗，易致患者大量脱水最终死亡。霍乱弧菌致病机制的相关研究主要集中在黏附相关蛋白、细胞毒性、摄铁系统、宿主防御、毒力调控等方面。

3.2.1 黏附相关蛋白 霍乱弧菌主要由Ⅳ型菌毛、鞭毛、生物膜相关蛋白1、生物膜结构调节剂C发挥黏附作用。FLOYD 等［23］提出3"，5"-环状二胍酸盐（c-di-GMP）可通过调节菌毛伸展影响霍乱弧菌定植能力的模型，为霍乱弧菌感染提供新的治疗思路。

3.2.2 细胞毒性 霍乱弧菌通过分泌霍乱毒素（CT）、霍乱弧菌溶细胞素（VCC）、Rtx、肠毒素、封闭带毒素、Cholix毒素、MARTX、血凝素蛋白酶、甘露糖敏感血凝素等造成对细胞的毒力作用。CT 由ctxAB基因编码，其释放到小肠可引起腹泻，且CT 可转化为CTXφ 感染新的霍乱弧菌株。VCC 是一种膜损伤蛋白毒素，可在肠上皮细胞引发炎性反应，OU 等［24］早期研究发现霍乱弧菌蛋白酶可分解VCC 消除炎症反应，为治疗霍乱弧菌感染提供思路。霍乱弧菌RTX 毒素由rtxA基因编码，其相关调节机制目前尚不明确。

3.2.3 摄铁系统 霍乱弧菌摄铁系统机制与创伤弧菌类似，通过铁转运蛋白摄取铁。

3.2.4 宿主防御 霍乱弧菌通过氨基酰化与环状GMP-AMP 合成酶（cGAS）/干扰素基因刺激蛋白（STING）通路进行宿主防御。BENGOECHEA［25］发现，LPS 氨基酰化在霍乱弧菌对抗菌肽的耐药性中起着关键作用，但具体机制尚不明确。cGAS-STING通路通过cGAS 蛋白感知DNA 后产生cGAMP 信号分子，与STING 蛋白结合并激活免疫反应进行宿主防御［26］。

3.2.5 毒力调控 霍乱弧菌QS调节因子为霍乱自身诱发因子-1 和自身诱发因子-2，可作预防霍乱感染的治疗靶点选择。霍乱弧菌发挥主要作用的细菌分泌系统类型为T6SS，STEVEN 等［27］实验揭示T6SS效应蛋白VgrG-3 可裂解细菌细胞壁骨架结构，但目前对霍乱弧菌T6SS遗传调控、效应因素机制尚不明确。霍乱弧菌主要由ToxR 转录因子进行毒力调控作用，其可调控CT 的产生，还可控制ompU和ompT基因的表达。

3.3 感染治疗方法 霍乱弧菌感染引起的霍乱可并发脱水和电解质紊乱，补液对其治疗至关重要，治疗初期即应充分补液，可口服补液辅以静脉补液。营养干预措施包括在纠正体液不足后立即恢复高能量饮食，以防止营养不良及包括低钾血症和低血糖在内的即时并发症；对于严重营养不良者和腹泻的儿童，建议锌治疗。一旦初期体液充足、呕吐症状纠正，即可采用阿奇霉素和环丙沙星等进行抗生素治疗以加速康复。霍乱预防重在接种疫苗，目前有两种口服霍乱疫苗，并在积极开发新的疫苗。

4 铜绿假单胞菌的分布分型、致病机制及感染治疗方法

4.1 分布分型 铜绿假单胞菌属于假单胞菌产色素细菌属，在海水中广泛分布，其产生的色素可减轻阳光辐射造成的伤害，故大多生活在海水表层。根据铜绿假单胞菌菌落形态及是否产生藻酸盐形成生物膜而分为黏液型和非黏液型，并且两种形态在一定条件下可相互转化。对于铜绿假单胞菌的分型鉴定，可使用按国际抗原分型系统制备的标准血清进行玻片凝集实验，还可应用抗菌谱、分子分型等方法。具体方法为随机扩增多态性DNA，多位点序列分型，肠杆菌基因间重复共有序列PCR，多位点可变数目串联重复序列分析等，对铜绿假单胞菌的acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA、trpE等基因进行分型鉴定［28］。

4.2 致病机制 铜绿假单胞菌可感染人体的任何部位，是引发院内感染的主要致病菌，可引起伤口感染、呼吸道感染、泌尿系统感染、腹膜炎等。海洋途径感染主要可导致伤口感染和脓毒症，造成急性或慢性感染，严重可致机体死亡。铜绿假单胞菌属假单胞菌属，其致病机制与创伤弧菌既有相似之处又有差异，致病机制的相关研究主要集中在黏附相关蛋白、细胞毒性、宿主防御、分泌系统、毒力调控等方面。

4.2.1 黏附相关蛋白 铜绿假单胞菌黏附相关蛋白为菌毛、鞭毛等黏附素，通过吸附于细胞表面并分泌大量黏多糖使细菌黏附进入，且具有毒力作用，可抑制细胞免疫反应。

4.2.2 细胞毒性 铜绿假单胞菌中发挥毒力作用的因子主要是外毒素A（ETA）、蛋白酶LasB 和磷脂酶C。JENKINS 等［29］报道，ETA 可诱导肥大细胞凋亡。LasB 是一种金属蛋白酶，可分解弹性组织，水解胞外基质，破坏细胞正常生理功能。

4.2.3 宿主防御 在铜绿假单胞菌中，主要是藻酸盐起到宿主防御功能，具体作用如下：保护于细菌表面，减少与免疫攻击复合物和抗生素的接触；使铜绿假单胞菌黏附力增强；形成凝胶状基质连接细胞，以形成较厚生物膜。铜绿假单胞菌摄铁系统机制与创伤弧菌类似。

4.2.4 分泌系统 铜绿假单胞菌中有T3SS 和T6SS 两种细菌分泌系统，T3SS 可影响机体免疫反应，对机体造成持续易感，是铜绿假单胞菌致病过程发挥作用的主要分泌系统。已确定T3SS 4 个相关的效应物-ExoY、ExoS、ExoT、ExoU。ExoY 是宿主因子依赖性腺苷酸环化酶，可改善血管渗透性，破坏肌动蛋白细胞骨架；ExoS 可抑制细胞迁移，诱导细胞凋亡；ExoT 能抑制细胞运动和分裂，诱导细胞死亡；ExoU 可分解胞膜磷脂，裂解细胞［30］。对T6SS研究较少，其致病机制为细菌外膜受到膜扰动后分泌释放效应蛋白杀伤宿主细胞，可介导铜绿假单胞菌对外源基因的免疫防御机制，使自身排斥外源基因。

4.2.5 毒力调控 铜绿假单胞菌特有QS-喹诺酮信号（PQS）系统，PQS 可调节多种毒力因子合成，在铜绿假单胞菌感染肺部及慢性化发展中发挥重要作用。

4.3 感染治疗方法 铜绿假单胞菌感染早期应用抗生素治疗，轻症可单用β-内酰胺类、氨基糖苷类，严重者应β-内酰胺与氨基糖苷联合用药或单用环丙沙星。重症患者首先应选择广谱的强力抗菌药，而后根据病原学培养结构调整抗菌药物，据早期临床统计，此种治疗方法患者病死率明显低于初始治疗错误者［31］。与单药治疗相比，联合用药治疗铜绿假单胞菌的初始治疗可能更有效。这提示大量医院感染中耐多药铜绿假单胞菌的流行，迫切需要开发针对此类细菌的抗菌素耐药性替代疗法。目前，针对QS 及其相关调控因子的抑制剂已被开发并开始治疗铜绿假单胞菌感染，同时干扰T3SS 和T6SS 关键调控因子也是治疗铜绿假单胞菌感染的潜在策略［32］。毒力调控因子（如VqsM、AlgR、CdpR、RpoN、CysB、AnvM 和VqsR）也可成为抑制铜绿假单胞菌毒力的潜在药物靶点。噬菌体、疫苗和抗菌肽在治疗铜绿假单胞菌感染上具有前景。

综上所述，海洋致病菌分布广泛，且接触或食用携带有海洋致病菌的海水与水产品便可感染，危害沿海居民身体健康及影响水产品养殖业发展。海洋致病菌多分布于沿海、海洋和河口环境，常使用定性PCR 法根据其基因型进行分型鉴定，各种海洋致病菌致病机制既有相似之处又有独到之处，目前研究集中在黏附相关蛋白、细胞毒性、宿主防御、摄铁系统、分泌系统、毒力调控等方面，但一些机制尚不明确，如对Tad pili 保护创伤弧菌免受补体攻击的机制尚不深入，对副溶血性弧菌定植于肠道的机制了解甚少，霍乱弧菌RTX 毒素的调节机制仍未知，霍乱弧菌T6SS 遗传调控、效应因素机制尚不明确。海洋致病菌的临床治疗方面现仍停留于抗感染治疗，相应靶点药物较少，可依据新的靶点探索治疗药物和疫苗，如tdh2转录的抑制因子CalR，创伤弧菌感染的疫苗抗原和免疫靶点选择-LptD，影响霍乱弧菌定植能力的治疗的靶点选择c-di-GMP，相关黏附因子、毒力因子的基因靶点等，为治疗和预防海洋致病菌感染提供有效途径。