上调miR-155-5p对脊柱结核病模型小鼠的干预作用

吴术其

脊柱结核的发病率占全身骨关节结核的首位，其中又以椎体结核占大多数,脊柱结核主要源自于肺结核，临床常见的表现有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等肺结核症状，长期患有脊柱结核的患者会引起脊柱椎体的骨破坏[1-3]。MicroRNAs (miRNAs)是小型、高度保守的RNA分子，通过碱基配对调节其同源mRNA的分子表达在个体的发育、细胞增殖、分化和细胞周期中均发挥重要作用。miR-155-5p可对泡沫细胞动脉粥样硬化的减慢具有预测作用，同时已有数据显示可作为鳞状上皮内宫颈癌的潜在诊断标志物，但其在脊柱结核病中的变化、对破骨的影响和作用机制尚不清晰[4-6]。本研究将探究miR-155-5p在脊柱结核病模型中的变化，并通过上调miR-155-5p探究其对破骨信号通路RANK/NF-κB的影响，为其在临床脊柱结核病中发挥的作用提供理论基础。报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级C57BL/6小鼠，8～10周龄，雄性，体重(22±2)g，由北京维通利华实验动物中心提供[SYXK(京)2017-0033]。

1.2 药品与试剂 水合氯醛购自天津市申泰化学试剂有限公司，Trizol 购于美国invitrogen 公司， agomiR-155-5p及miR-NC由上海吉玛制药技术有限公司合成，固绿染液(批号：G2551)北京索莱宝科技有限公司，抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase，Trap)染色试剂盒(批号：G1492)，北京索莱宝科技有限公司，Anti-RANK antibody (ab200369)，Anti-NF-kB p65 antibody(ab32536)，Anti-NF-kB p65(phospho S536) antibody (ab76302)，Anti-GAPDH antibody (ab8245)及二抗抗体购于美国Abcam公司。小鼠 IL-1 β ELISA试剂盒(RAB0274)、小鼠 IL-6 ELISA 试剂盒(RAB0308)、小鼠 IL-17 ELISA 试剂盒(RAB0263)、小鼠肿瘤坏死因子ELISA检测试剂盒(RAB0477)购于美国Sigma公司。

1.3 仪器设备 ABI 7500 qPCR仪，美国ThermoFisher 公司，Leica RM2015 切片机，德国 Leica 公司，-80℃超低温保存箱，美国 Thermo 公司，4℃冰箱，购自合肥美菱股份有限公司，SC-3610 低速离心机，购自安徽中科中佳科学仪器有限公司，美国，电子秤 AL104 瑞士METTLER TOLEDO公司，室温离心机Eppendorf minispin 德国Eppendorf公司，Labsystems Multiskan352酶标仪 美国MS公司，DM-BA400-B 显微镜，美国Motic 公司，Western blot电泳仪，BIO-RAD公司。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠分组及饲养条件：8～10周龄雄性C57BL/6小鼠于SPF级鼠房饲养，室温调节在(25±2)℃,相对湿度维持在40%～65%，12/12 h昼夜交替照明，自由摄取食物和饮用水，适应性饲养1周后造模。

1.4.2 小鼠脊柱结核病动物模型的建立、分组及处理：将小鼠随机分为4组，对照组，模型组，NC组和实验组，每组10只。模型组、NC组和实验组采用浓度为108 CFU/ml的H37Rv标准菌株悬液0.1 ml建立脊柱结核病模型。将10%水合氯醛按照3 ml/kg的剂量腹腔注射，待小鼠麻醉后，取侧卧位，将小鼠左侧季肋区剃毛备皮。沿髂嵴上方垂直于椎体方向进针，针头进入椎体后推注，将 0.1 ml混合胶的菌悬注射于模型组、NC组及实验组，对照组注射等体积0.9%氯化钠溶液，针头在小鼠椎体内停留30 s，待胶凝固后，旋转拔出针头。造模后，NC组给予miR-NC尾静脉注射，模型组给予miR-155-5p agomiR尾静脉注射，对照组给予等量0.9%氯化钠溶液尾静脉注射，8周后4组小鼠用于实验检测[7]。

1.4.3 小鼠骨组织Trap染色:造模成功后,将所取小鼠骨组织置于 4%多聚甲醛中固定。48 h后将骨组织样本进行脱钙、脱水及石蜡包埋并切片为 3 μm 厚的石蜡切片。脱蜡复水后，将切片置于Trap 孵育液反应 1 h，并进行甲基绿染液染色 5 min。切片取出纯水清洗2遍后，采用95%乙醇梯度脱水，二甲苯透明，透明树脂封片[8]。

1.4.4 小鼠外周血Elisa检测:4组小鼠通过眼眶取血0.5 ml，分离血浆后，加入酶标抗体，37℃,30 min，加入底物液，每孔100 μl,置37℃避光放置5 min,加入终止液显色，每孔加入反应终止液50 μl终止反应,于20 min内测定实验结果，酶联检测仪测定吸光度OD值，每组实验设置3个复孔[9]。

1.4.5 小鼠外周血miR-155-5p表达水平分析:用TRizol提取mRNA后，立刻按照试剂盒进行cDNA反转录，反转录进行qPCR，扩增条件:95℃ 预变性10 min，95℃ 变性10 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 20 s，共40个循环。以2-△△Ct计算miR-155-5p相对表达量。见表1。

表1 引物序列

1.4.6 Western blot 检测蛋白的表达:对组织进行裂解收取总蛋白，进行SDS-PAGE 电泳80 V 15 min，120 V 2 h， PVDF膜转模110 V 2.5 h，TBST 漂洗4次，5 min/次，使用5%脱脂奶粉封闭，TBST漂洗4次,5 min/次，加入一抗，二抗温孵育后，TBST漂洗4次，5 min/次，ECL 显色，发光仪曝光、拍照[11]。

2 结果

2.1 miR-155-5p在4组小鼠外周血中的表达水平 如图1所示，与对照组小鼠相比，模型组和NC组小鼠小鼠外周血miR-155-5p表达显著降低(P<0.01)，而实验组小鼠相对于模型组和NC组小鼠miR-155-5p表达显著升高(P<0.05)，但仍低于对照组(P>0.05)。见表2。

表2 miR-155-5p表达水平

2.2 MiR-155-5p对小鼠破骨细胞的影响 Trap 染色结果显示与对照组小鼠相比，模型组和NC组小鼠骨小梁结构稀疏(绿色)、紊乱，出现部分骨质断裂，破骨细胞数量增加(红色)，而实验组小鼠骨小梁结构稀疏有所缓解、破骨细胞数量减少。见图1。

图1 4组小鼠骨组织破骨细胞变化(Trap 染色×200)；A对照组；B模型组；C NC组；D试验组

2.3 4组小鼠骨质的相关参数分析 与对照组小鼠比较，模型组和NC组小鼠出现骨小梁数目和骨小梁厚度的显著下降(P<0.01)，而实验组小鼠相对于模型组和NC组小鼠骨小梁数目和骨小梁厚度显著升高(P<0.01)，但仍低于对照组(P>0.05)。见表3。

表3 MicroCT 检测4组小鼠骨质的相关参数

2.4 4组小鼠外周血炎性因子比较 与对照组小鼠比较，模型组和NC组小鼠外周血IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α表达水平显著升高(P<0.01)，而实验组组小鼠相对于模型组和NC组小鼠IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α有降低趋势，但仍显著高于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 4组小鼠外周血炎性因子比较

2.5 4组小鼠结核病灶组织RANK、NF-κB及p-NF-κB蛋白表达的变化 与对照组比较，模型组和NC组小鼠外周血破骨信号分子RANK、NF-κB及NF-κB磷酸化分子p-NF-κB蛋白表达具有上升趋势(P<0.01)，而实验组相比于模型组和NC组出现显著下降趋势(P<0.01)，蛋白质相对定量进一步验证了这种趋势(P<0.01)。见表5。

表5 4组小鼠结核病灶组织RANK、NF-κB及p-NF-κB蛋白表达的变化

2.6 miR-155-5p 靶基因的预测 miRDB软件预测Smad2为miR-155-5p，双荧光素报告酶实验进一步证实靶向关系，Westernblot结果表明，与对照组比较，模型组和NC组小鼠外周血TGF-β1和Smad2表达具有下降趋势(P<0.01)，而试验组与模型组和NC组比较显著上升(P<0.01)，蛋白质相对定量进一步验证了这种趋势(P<0.01)。见图2，表6、7。

图2 miR-155-5p的靶向关系

表6 4组TGF-β和Smad2蛋白表达水平比较

表7 双荧光素酶报告实验荧光素酶活性测定结果

3 讨论

脊柱结核病是一种慢性病变，多为肺结核发展到一定程度时，经过血液传播到脊柱以后，在椎体内或椎体周围聚集，引起骨质破坏，形成脊柱结核，多见于胸椎和腰椎。患者可出现腰部僵硬，拾物时无法弯腰，脊柱前柱破坏比较严重时，形成后凸畸形，驼背，寒性脓肿，脓肿中含有大量的干酪样物质、肉芽组织、死骨和坏死椎间盘组织。脓肿过大时，脓液可沿软组织间隙蔓延，病变突破椎体后壁，压迫脊髓或马尾神经，可引起不同程度的下肢瘫痪[12,13]。

MicroRNA通常可以有多个靶基因，多集中于UTR区域，几个miRNA也可以同时调节同一个基因,在细胞内具有多种重要的调节作用。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。miR-155-5p在多种疾病的发生发展中发挥重要作用，研究表明抗Hp治疗后萎缩胃黏膜组织中miR-155-5p表达水平显著升高，miR-1296-5p、miR-155-5p在萎缩胃黏膜组织均呈低表达状态并且二者联合可以提高不良预后预测效能；miR-155-5p能通过抑制Sirt1表达调节滋养层细胞的迁移和侵袭从而影响子痫前期的发生，还能通过负向调控c-SKI的表达影响冠状动脉内皮细胞增殖和胶原的合成[14-16]。本研究表明，在脊柱结核病小鼠黏膜组织中miR-155-5p出现了显著的低表达，上调miR-155-5p表达后，可以显著抑制外周血炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α释放，抑制骨小梁的破坏，增加骨小梁数目和厚度，减少骨组织损伤，降低破骨细胞数量，从而发挥骨保护作用。

RANK/NF-κB是细胞内重要信号通路，RANK是从小鼠类巨噬细胞的破骨细胞前体细胞中复制出的破骨细胞分化因子受体，属于Ⅰ型三聚化跨膜蛋白。RANK胞内区域包含多个受体相关因子结合区域，在破骨细胞的前体细胞、成熟破骨细胞、软骨细胞等中起重要作用，其可与TRAF-1、TRAF-3、TRAF-6及IL-1、IL-6、IL-15等结合，是激活JNK、Wnt等破骨相关信号通路活性的关键步骤。NF-κB是一种多极性基因调控蛋白，能调节多种参与免疫反应的细胞因子、炎性介质， NF-κB活化在破骨细胞活化中起着显著的作用，NF-κB依赖性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 升高，骨髓源性的破骨细胞前体由此被募集[17-19]。本研究表明，脊柱结核病灶部位RANK、NF-κB及p-NF-κB蛋白表达具有上升趋势，而上调miR-155-5p后， RANK、NF-κB及p-NF-κB蛋白表达具有下降趋势，提示miR-155-5p对脊柱结核病的骨保护作用与调控RANK/NF-κB信号通路相关，并且NF-κB蛋白的磷酸化引起的信号转导在此过程中发挥重要作用。

综上，在脊柱结核病小鼠外周血中miR-155-5p表达显著降低，上调miR-155-5p表达可以抑制炎性因子的释放，对小鼠脊柱结核有保护作用，抑制破骨细胞的分化形成，增加骨小梁数目及厚度，其机制可能与RANK/NF-κB信号通路的调控和磷酸化相关。