人经血干细胞移植对宫腔粘连组织中α-SMA、TGF-β1及钙粘蛋白E含量的影响

李玲 单铁英 刘聿谨 宋玉杰 李伟 王芳 杨庆 贾慧

宫腔粘连是子宫内膜组织由于多种致病因素造成的宫腔局部甚至全部出现粘连。患此病者经量稀少、经期腹痛、闭经、易流产以及不孕等症状[1,2]。严重影响有生育要求的女性患者的生殖能力。子宫内膜组织呈现纤维化改变为宫腔粘连的主要病理学特点，也是众多医学界的研究者们研究和治疗此病的关键入手点。已有实验研究显示，体外培养的人经血干细胞(human menstrual stem cells,MenSCs)在适当条件和细胞因子的诱导下可以向子宫内膜上皮细胞转化[3,4]。但笔者查阅文献后发现将其接种到宫腔粘连的组织表面后，能否起到修复作用尚不清楚。因此，我们将MenSCs均匀接种到发生粘连的宫腔内表面，观察子宫内膜组织的结构改变及内膜组织中的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及钙粘蛋白E含量的变化，探索MenSCs接种改善宫腔黏连的机制，为宫腔粘连的治疗提供一种新策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 获取经血：收纳来自邯郸市中心医院体检中心检查的健康女性，平均年龄(34.1±1.9)岁，详细告知情况后，自愿签署知情同意书，均采用无菌方法处理后的杯子收集经血标本，迅速送到在实验室的超净台中，无菌分离出MenSCs。

1.1.2 实验动物：SD大鼠购自河北工程大学医学部动物研究所，许可证号：SCXK(冀)2020-6-316，合格证编号：614273，雌性，月龄(12.0±1.7)月，体重(327.3±11.7)g。

1.1.3 主要试剂：苏木素-伊红染液、Masson 染液、α-SMA、TGF-β1及钙粘蛋白E抗体和免疫组化试剂盒均购自R&D System。

1.2 方法

1.2.1 MenSCs的纯化、鉴定及培养：向收集的经血中加入等容积的缓冲液，放入12 cm直径离心机中，1 200 r/min持续转动10 min，吸出离心管上端的悬液，滴入单核细胞分离液，再离心0.5 h，在离心管中出现一薄层的白膜，仔细用吸管吸出薄层含有细胞的白膜，加入缓冲液清洗细胞后，留取少许细胞用于形态观察、流式细胞术用于检测细胞种类鉴定。其余细胞放入中等培养瓶中，置于培养箱中孵育。

1.2.2 大鼠造模及分组：采用麻醉液麻醉处于非动情期的大鼠18只，沿大鼠的腹中线剪开腹部皮肤，充分显露出子宫的左右侧支，搔刮子宫右侧支的宫壁，搔刮时当手感到有粗糙感时即可停止，缝合腹部后放回笼中饲养1周。实验分为对照组、模型组和MenSCs组，每组6只。对照组：正常健康的大鼠；模型组：搔刮子宫右侧支宫壁的大鼠；MenSCs组：模型组大鼠饲养1周后向粘连宫腔接种浓度为2×106个/ml的MenSCs 200 μl。3组分笼饲养28 d后，均取子宫的右侧支放入固定液中固定，以备进行后续实验。

1.2.3 子宫内膜组织切片的制作、染色及形态结构的观察：固定好的3组小块子宫内膜组织，从70%的乙醇开始到100%的乙醇结束，依次浸没于百分含量逐渐升高的乙醇中脱去组织中的水分，然后浸没于融化的液态石蜡中，冷却变硬固化后，固定在切片机里切割为标准厚度的组织薄片，从100%的乙醇开始到70%的乙醇结束，依次浸没于百分含量逐渐降低的乙醇中脱去组织中的石蜡，最后浸没于水中。遵循试剂的操作说明对组织切片行苏木素-伊红染色和Masson 染色。观察子宫内膜组织的形态结构的变化，并统计比较3组子宫内膜组织中的腺体个数以及纤维化面积。

1.2.4 蛋白印迹技术分析组织中α-SMA、TGF-β1及钙粘蛋白E的相对值：将3组相同质量的块状子宫内膜组织分别加入适量的缓冲液放入匀浆机中，快速打碎并研磨为均匀的浆液，在浆液中加入适当配比的预冷的裂解液静置20 min，离心机离心后得到的上清液即为组织里的总量蛋白，取少许的蛋白样品，确定其中的蛋白含量。将蛋白热变性后，使用移液器定量吸取40 μg注入提前制备好的浓缩凝胶上端得小孔底端，将胶置于含有电泳液的电泳槽中，设置恒定电压和恒定电流后启动电泳，持续2 h。截取经电泳分离的胶块里的目的蛋白条带，与薄膜贴紧后放入转膜仪中，将目的蛋白条带转到薄膜里，常温下逐次投到脱脂奶粉液、第一抗体溶液(α-SMA、TGF-β1及钙粘蛋白E)、洗膜液、第二抗体溶液、洗膜液。进入暗室中将蛋白条带显色和显影于X线片中。扫描X线片中的蛋白条带，以β-actin为内参分析并统计比较各组X线片里的平均灰度相对值。

2 结果

2.1 MenSCs的形态结构观察及类型鉴定结果 刚分离出来并且经过纯化的MenSCs呈单个、散在、体积较小的圆形，经1周常规培养后，贴培养瓶的瓶底壁生长，体积增大呈长梭状。采用流式细胞技术分析发现，细胞表面的分子类型以及它们各自的表达率分别为OCT-4(96.12±0.13)%、CD-45(1.32±0.11)%、Strol-1(95.45±0.19)%，这些分子类型和它们的表达率充分证明获取的细胞为MenSCs。见图1。

2.2 3组子宫内膜组织的结构比较 3组子宫内膜组织经苏木素-伊红染色后发现，对照组内膜组织从外到内依次为上皮层和固有层，固有层中有腺体。模型组内膜组织无上皮层，只显示固有层并且其厚度增加，固有层中的基细胞数量较少而基质含量增多，其中没有发现腺管的结构。MenSCs组的内膜组织显示出新生长出来的上皮层，固有层基细胞数量较多而基质含量减少，其中可见数个腺管结构。见图2，表1。

图2 3组内膜组织的形态结构(苏木素-伊红染色×200)；A 正常组；B 模型组；C MenSCs组

2.3 3组内膜组织纤维化程度的比较 3组子宫内膜组织经过Masson 染色后显示，组织中的蓝色面积表示为纤维化面积，3组内膜组织呈现出不同程度的蓝色面积。对照组内膜组织固有层中蓝色面积含量较少，纤维化面积占总组织面积的比例较少。模型组固有层蓝色面积所占比例较对照组显著增多(P<0.05)。MenSCs组蓝色面积所占比例较模型组减少(P<0.05)。见图3，表1。

图3 3组内膜组织的纤维化面积(Masson 染色×200)；A 正常组；B 模型组；C MenSCs组

表1 3组腺体数量、纤维化面积比例比较

2.4 3组内膜组织中α-SMA、TGF-β1及钙粘蛋白E含量的比较 模型组内膜组织中的α-SMA和TGF-β1含量较对照组增加，而钙粘蛋白E含量降低 (P<0.05)；MenSCs组内膜组织中的α-SMA和TGF-β1含量较模型组降低，而钙粘蛋白E含量较模型组升高 (P<0.05)。见表2，图4。

图4 免疫印迹显示各组内膜组织中α-SMA、TGF-β1及钙粘蛋白E的蛋白条带灰度

表2 3组内膜组织中α-SMA、TGF-β1及钙粘蛋白E含量比较

3 讨论

正常的子宫内膜组织有表面的上皮组织和其下面的固有层组成，固有层中含有丰富的毛细血管，因此，宫腔镜下显示为粉红色。而宫腔粘连的子宫内膜组织正常的上皮组织消失，其下面的固有层结缔组织增厚并且发生纤维化的病理改变为宫腔粘连的病理特点，宫腔镜下可以显示，黏连的子宫腔的体积窄小，纤维化的病变部位内膜组织呈白色的斑状或呈条索状，质地较硬。导致宫腔发生黏连的致病因素较多，宫腔粘连的患者经常以多次流产或不易怀孕而来医院就诊，黏连程度严重的患者经常规治疗后比较容易复发。因此，探索宫腔粘连的发病机制，发现新的有效的治疗此病的作用靶点尤为重要。

研究发现TGF-β为导致机体多种器官组织发生纤维化改变的起关键作用的生物学细胞因子，其中TGF-β1为生物学活性最强的成员[5,6]。如果组织中TGF-β1含量异常增高，那么其发生纤维化的进程就会越快。其具体作用机制为：(1)它可以增强结缔组织中的成纤维细胞的活性并使其分泌大量的基质成分，刺激抑制基质成分降解的生物学因子合成增加，而基质成分降解的酶蛋白合成降低，从而导致过量的基质成分沉积在细胞间隙中，最终导致组织发生纤维化病变[7,8]；如果减弱或消除组织中TGF-β1的活性能明显改善多种器官组织的纤维化病变进程[9]。(2)TGF-β1在组织中的含量异常增高，将会阻止上皮细胞的正常生长和生物学活性，并能使之向间质细胞的表型和特性转分化[10-13]，上皮细胞表面的起粘附作用的分子-钙粘蛋白E表达缺失，而表达间质细胞特有的标志性分子α-SMA，并能合成和分泌大量的基质成分到细胞间隙中[14,15]。已有文献证实宫腔粘连的内膜组织中TGF-β1的含量高于正常的子宫内膜组织，这说明TGF-β1参与了宫腔粘连的发生和发展过程[16,17]。

我们的实验研究结果表明：宫腔粘连的内膜组织中无上皮组织覆盖，只显示固有层并且其厚度增加，固有层中的基细胞数量较少而基质含量增多，其中没有发现腺管的结构。组织中所含的纤维化面积增多，α-SMA和TGF-β1的含量升高、而钙粘蛋白E的含量降低。

近年来的实验研究表明，在体外适当细胞因子的培养下，有许多种类从机体来源的干细胞，例如从胎儿羊膜、成人的骨髓及脂肪组织获取的干细胞，经过适当的诱导均能分化为子宫内膜细胞；并且将其接种到粘连的内膜组织表面后，均能改善宫腔黏连的程度并能起到修复的作用[18-20]。但它们的获取途径经常会对机体造成不同程度的创伤，且存在较多的风险和伦理学争议。MenSCs存在于子宫内膜组织里，可随月经产生的血液排出体外，其有干细胞的特性，并且具有免疫排斥反应弱、获取途径容易、无风险和伦理争议等优点[21,22]。

我们的实验研究结果表明：将MenSCs接种到粘连组织表面后，内膜组织会显示出新生长出来的上皮层，固有层基细胞数量较多而基质含量减少，其中可见数个腺管结构，组织中的纤维化面积减少，α-SMA和TGF-β1降低，钙粘蛋白E升高。均说明MenSCs接种到宫腔黏连组织表面后，能分化为子宫内膜上皮细胞，修复内膜组织的纤维化损伤和改善宫腔黏连，为探索宫腔粘连的治疗方案提供了新的思考方向。