谷子源可溶性膳食纤维对肝癌细胞HepG2的抑制作用

李汉卿，王瑾，史江颖，张晓莉，单树花 ，李卓玉，*

（1.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西大学 生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006）

0 引言

原发性肝癌的主要组织学形式是肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC），是世界上第五大常见的恶性肿瘤，其具有病情进展快、恶性程度高、治疗难度大及生存率低的特点，也是肿瘤致死率第二位的癌症[1]。目前普遍认为原发性肝癌是多基因、多因素、多步骤的疾病，其中导致肝癌发生的因素很多，包括慢性乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、吸烟等[2-4]，但是饮食因素如过度饮酒、食用黄曲霉毒素污染的食物等被认为是诱发肝癌的重要危险因素[5]。目前，对于肝癌的治疗方法主要包括手术治疗、放射疗法和化学疗法。手术治疗对患者的创伤较大，易产生一系列手术并发症，降低患者的免疫力。放射疗法肿瘤特异靶向性差，会破坏正常细胞组织，产生血液改变、恶心呕吐等副作用。而化学疗法对正常细胞缺乏选择性，具有严重的毒副作用[6]，且易产生肿瘤耐药[7]。因此，寻找一种安全、无毒、高效营养干预肝癌细胞增殖的功能分子，对于肝癌的防治具有重要意义。

谷子（Setaria italica）广泛种植于全世界，是我国北方地区种植的主要农作物之一，为山西名优产品。自古有“五谷为养”的说法，谷物是膳食纤维、维生素、矿物质、植物营养素等多种营养素的良好来源[8]，具有抗癌、抗炎、抗菌及抗氧化等药理学特性。谷子在经过碾磨脱糠得到小米的精细化加工过程中，虽然谷糠易被忽视，但其中同样含有多种具有生物活性的营养物质。已有研究发现谷糠中结合态多酚对人结肠癌细胞HCT-116、人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7等肿瘤细胞的增殖均具有显著的抑制作用[9]；谷糠中的一种过氧化物酶在体外和体内均已证实能够通过抑制CD36和STAT3的表达来减轻动脉粥样硬化病症[10]。因此，谷糠具有许多潜在的营养物质有待更多研究。越来越多的研究表明，全谷物的摄入与肥胖[11-12]、2型糖尿病[12-15]和非酒精性脂肪肝[16-17]等已知肝癌的诱发因素的降低相关。而全谷物中的膳食纤维含量非常丰富，这种谷物纤维除了改善胰岛素敏感性、调节代谢、减少系统性炎症，还能够改变肠道微生物的组成，促使肠道微生物相关代谢产物丁酸盐的增加[18-19]，提高肠道完整性[20]，可有效减缓肝癌的发生与发展。流行病学研究表明，膳食纤维的摄入可有效降低和预防结肠癌、乳腺癌等多种疾病的发病几率[21-22]。但是，谷子源膳食纤维抗肝癌活性鲜见报道，因此，探究谷子源膳食纤维对肝癌细胞的干预能够为肝癌的防治提供新的思路。

本研究分别从全谷物、小米和谷糠中运用酶法结合化学法获得三种谷子源可溶性膳食纤维，并对三种膳食纤维的含量和得率进行了分析，进一步评价三种膳食纤维的毒性作用和对人肝癌细胞HepG2的抑制效应，为将其进一步研发成预防肝癌保健品和药物中间体提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

谷糠、全谷物、小米（均为晋谷21号）购于山西农科院。

人肝癌细胞HepG2、人正常肝细胞HL-7702均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

RPMI-1640及DMEM培养基均购于Gibco公司；胎牛血清购于生工生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购于美国Sigma公司；噻唑蓝（MTT）、胰蛋白酶、α-淀粉酶（高温淀粉酶）（40 000 U/g）、碱性蛋白酶（200 000 U/g）均购于北京索莱宝科技有限公司；纤维素酶（50 U/mg）购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电热鼓风干燥箱（中国，博迅）；真空冷冻干燥仪（中国，兴芝）；电热恒温水浴锅（中国，一恒）；台式高速冷冻离心机（德国，Eppendorf）；电子天平（美国，Ohaus）；pH计（上海，三信）；CO2细胞培养箱（美国，Thermo）；倒置显微镜（日本，Nikon）；真空旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3 谷子源可溶性膳食纤维的制备

膳食纤维的提取主要包括物理法、化学法和酶法等3种方法。本实验参考黄冬云[23]的方法：分别称取适量小米、全谷物和谷糠，粉碎后过60目筛，料液比1∶12加pH 4.5的水溶液，60℃水浴搅拌2 h以去除植酸→11 000 r/min，离心5 min，弃上清→沉淀按料液比1∶12加蒸馏水，95℃糊化30 min→加高温淀粉酶（200 U/g），95℃、pH 6.0酶解30 min→加碱性蛋白酶（5 400 U/g），50℃、pH 10酶解 5 h→沸水浴10 min，灭酶活→4 000 r/min离心20 min→收集上清；沉淀烘干，过100目筛，按料液比1∶10加0.05 mol/L，pH 4.8的柠檬酸−柠檬酸钠缓冲液，加纤维素酶（200 U/g），混匀后，于50℃水浴3 h→沸水浴10 min灭酶活→4 000 r/min离心20 min→收集上清；按 1∶4（V/V）向收集的上清液中加入体积分数为95%的乙醇，静置12 h→收集沉淀物，冻干。

1.4 细胞培养

HepG2细胞培养于含体积分数10%胎牛血清（含100 U/mL青霉素和链霉素）的DMEM高糖培养基中，HL-7702培养于含10%胎牛血清（含100 U/mL青霉素和链霉素）的RPMI-1640培养基中，5% CO2（体积分数）、37℃培养箱培养。

1.5 细胞毒性和增殖实验

因人正常肝细胞HL-7702生长速度慢，人肝癌细胞HepG2生长速度快，故收集对数期人正常肝细胞HL-7702，将细胞密度调整为10 000～15 000个/100 μL，收集对数期人肝癌细胞HepG2，将细胞密度调整为4 000～5 000个/100 μL，接种于96孔板，以确保细胞培养48 h后，二者细胞数量基本一致。5% CO2、37℃培养12 h贴壁后，加入终浓度分别为1，2，4 mg/mL的全谷物、小米和谷糠的可溶性膳食纤维，各设置5个复孔做重复对照，同时设置5个空白对照，培养48 h，所有孔 PBS 清洗 2次，换 100 μL新鲜培养基，加 20 μL MTT，继续培养4 h，小心吸弃培养基后，加入150 μL DMSO，于微孔板振荡器振荡10 min，酶标仪570 nm波长测吸光度。

1.6 细胞克隆形成实验

收集对数期人肝癌细胞HepG2调整细胞密度5 000个/孔，接种于24孔板培养24 h，加入终浓度为1、2、4 mg/mL的谷糠可溶性膳食纤维处理细胞1周，同时设置空白对照。用免疫固定液覆盖细胞，室温固定20 min，0.1%结晶紫染液（m∶V）染色15 min，烘干后显微镜下观察拍照。最后，每孔中加入1%SDS（m∶V）充分溶解细胞内结晶，570 nm波长测定其吸光度对细胞克隆实验的结果并进行量化分析。

1.7 划痕实验

收集对数期人肝癌细胞HepG2，调整细胞密度，接种于铺有灭菌枪头圈的24孔板中，使得过夜培养后圈内形成密度大于90%的单层细胞。细胞贴壁后，用无菌镊子取出枪头圈，用20 μL无菌枪头均匀划痕后，PBS小心清洗2次，换入500 μL新鲜培养基，加入终浓度为0.1和0.4 mg/mL的谷糠可溶性膳食纤维，同时设置空白对照，每个样品设3组重复对照，于5% CO2，37℃培养。每24 h用倒置显微镜观察HepG2细胞的增殖情况。愈合率的计算方法为：

1.8 细胞凋亡测定

收集对数期人肝癌细胞HepG2，调整细胞密度，接种于60 mm小皿中，贴壁后加谷糠可溶性膳食纤维（1、2、3 mg/mL）处理，用胰酶消化，离心收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入 100 μL Binding Buffer吹散细胞后，加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI Staining Solution，轻轻混匀后，室温避光孵育10 min，加入400 μL Binding Buffer，用流式细胞仪检测。

1.9 统计分析

所有数据平均做3次独立实验，以均数±标准误表示；采用单因素方差分析（ANOVA）进行多重比较，不同字母表示差异显著（P<0.05）；运用SPSS 17.0统计软件对所得数据统计分析，两组独立样本间平均数比较采用t检验，以P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 全谷物、小米和谷糠中可溶性膳食纤维的含量

利用酶法结合化学法，分别从10 g的全谷物、小米和谷糠中提取可溶性膳食纤维。结果如表1显示，全谷物可溶性膳食纤维的含量为1.007 g/10 g，小米可溶性膳食纤维的含量为1.586 g/10 g，谷糠可溶性膳食纤维的含量为0.301 g/10 g。全谷物、小米和谷糠可溶性膳食纤维含量依次是：小米可溶性膳食纤维>全谷物可溶性膳食纤维>谷糠可溶性膳食纤维。以上结果表明，小米可溶性膳食纤维最多，谷糠可溶性膳食纤维最少。

表1 全谷物、小米和谷糠中可溶性膳食纤维的含量（，n=3）Table 1 Contents of soluble dietary fiber in whole grain,millet and foxtail millet bran（，n=3）

表1 全谷物、小米和谷糠中可溶性膳食纤维的含量（，n=3）Table 1 Contents of soluble dietary fiber in whole grain,millet and foxtail millet bran（，n=3）

Species of dietary fiber Contents/g Total volume/mL Millet Whole grain Foxtail millet bran 10 g原材料提取所得上述膳食纤维,两组之间的显著性差异用不同字母表示,P<0.05 Concentration/（mg/mL）243.926±0.737 201.371±0.352 66.559±0.812 6.5±0.425 5±0.296 4.5±0.701 1.586±0.085 1.007±0.037 0.300 5±0.044 Composition ratio/%15.86±0.85a 10.07±0.37b 3.005±0.44c

2.2 谷子源可溶性膳食纤维的毒性评价

为了确定谷子不同部位的可溶性膳食纤维的安全性，将全谷物、小米和谷糠可溶性膳食纤维通过MTT法，检测其在不同浓度（0，1，2，4 mg/mL）对人正常肝细胞HL-7702的活力影响。图1显示，全谷物、小米和谷糠的可溶性膳食纤维在浓度分别为1，2，4 mg/mL时，对人正常肝细胞HL-7702的存活率均大于90%，表明全谷物、小米和谷糠可溶性膳食纤维对HL-7702细胞的正常增殖无明显影响。这说明3种可溶性膳食纤维在此浓度下对正常细胞无明显毒性作用。

图1 谷子源可溶性膳食纤维对HL-7702细胞增殖的影响（±s，n=3）Fig.1 Effects of soluble dietary fiber from foxtail millet on HL-7702 cells proliferation（±s，n=3）

2.3 谷子源可溶性膳食纤维对HepG2细胞的抑制作用

由图2可知，小米可溶性膳食纤维在浓度为2，4 mg/mL时对人肝癌细胞HepG2的增殖有显著抑制作用（P<0.05），全谷物和谷糠可溶性膳食纤维在浓度为1，2，4 mg/mL时对HepG2均有显著抑制作用（P<0.05），且具有浓度依赖性。其中，谷糠可溶性膳食纤维在浓度为4 mg/mL时，存活率为51.83%，与其他谷子源膳食纤维相比，谷糠可溶性膳食纤维对HepG2增殖的抑制作用最为显著（P<0.05）。因此，选择谷糠可溶性膳食纤维进一步研究其抗肝癌活性。

图2 谷子源可溶性膳食纤维对HepG2增殖的影响（，n=3）两栏间用不同字母表示有显著性差异，P<0.05Fig.2 Effect of soluble dietary fiber of foxtai millet on the proliferation of HepG2（，n=3）Significant differences between the two columns were indicates by different letters,P<0.05

2.4 谷糠可溶性膳食纤维对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

为了进一步证明谷糠可溶性膳食纤维的抗肝癌活性，采用细胞克隆形成实验评价谷糠可溶性膳食纤维对HepG2细胞增殖的影响。图3（a）显示，谷糠可溶性膳食纤维对HepG2细胞的克隆形成能力具有明显的抑制作用，且具有剂量依赖性，其抗增殖的效果与MTT结果一致。图3（b）是对图3（a）细胞克隆形成的实验结果，结果证明谷糠可溶性膳食纤维能够显著抑制HepG2细胞的克隆形成。

图3 谷糠可溶性膳食纤维对HepG2细胞活力的影响（，n=3），组间字母不同的栏目差异有显著性，P<0.05Fig.3 Effects of soluble dietary fiber from foxtail millet bran on HepG2 cell viability（，n=3）The columns with different letters between groups represented significant differences,P<0.05

2.5 谷糠可溶性膳食纤维对人肝癌细胞HepG2迁移的影响

为了进一步确定谷糠可溶性膳食纤维的抗肝癌效应。选择在对HepG2细胞无抑制作用的浓度（图4（b））下，采用细胞划痕实验检测谷糠可溶性膳食纤维对HepG2单层细胞的迁移作用。结果显示，与空白对照相比，谷糠可溶性膳食纤维浓度为0.4 mg/mL时，在24 h和48 h对细胞划痕愈合率的抑制分别达到7.72%和9.34%（图4（a），4（c））。谷糠可溶性膳食纤维不仅显著抑制了HepG2单层细胞的增殖，并且能够有效抑制HepG2细胞的迁移，且具有浓度依赖性。

图4 谷糠可溶性膳食纤维对HepG2细胞增殖的抑制作用（，n=3）组间字母不同的栏目差异有显著性，P<0.05Fig.4 Antiproliferative effect of soluble dietary fiber from foxtail millet bran on HepG2 cells（，n=3）The columns with different letters between groups represented significant differences,P<0.05

2.6 谷糠可溶性膳食纤维对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响

为了探讨谷糠可溶性膳食纤维对HepG2细胞凋亡的影响，采用流式细胞仪检测不同浓度谷糠可溶性膳食纤维（0，1，2，3 mg/mL）对HepG2细胞凋亡的影响，结果见图5。由图5可以看出，1 mg/mL谷糠可溶性膳食纤维处理后与对照相比，细胞凋亡率增加了2.45倍；2 mg/mL处理时，细胞凋亡率增加了3.83倍；3 mg/mL处理时，细胞凋亡率增加了4.95倍，表明膳食纤维能够通过诱导HepG2细胞凋亡进而抑制其增殖，且具有剂量依赖性。

图5 谷糠可溶性膳食纤维对HepG2细胞凋亡的影响（，n=3）组间字母不同的栏目差异有显著性，P<0.05Fig.5 Effect of soluble dietary fiber from foxtail millet bran on the apoptosis of HepG2 cells（，n=3）The columns with different letters between groups represented significant differences,P<0.05

3 讨论

已有研究表明膳食纤维摄入量与肝癌风险呈现潜在的负相关性，但因食物来源不同而有所不同，如部分水果或蔬菜的膳食纤维则与肝癌无相关性[24]。这可能是因为水果和蔬菜，特别是果汁中，含有较高的果糖和蔗糖，这些能导致有肝损伤或非酒精性脂肪肝的基础病患者病情加重，从而掩盖水果和蔬菜纤维的潜在益处[25-26]。王菁等[27-28]分别通过高脂饮食诱导，构建胰岛素抵抗动物模型和人群流行病学研究表明，增加不同种类全谷物的摄入量能够显著降低血糖水平，改善胰岛素抵抗；Xu等[29-30]通过对人群调查研究显示，全谷物的摄入与炎症标志物浓度呈负相关；增加谷物源膳食纤维的摄入量能够减轻胰岛素抵抗、改善代谢平衡、降低炎症，从而对肝癌具有一定的预防和治疗作用。目前研究已经发现海藻中提取的可溶性膳食纤维岩藻黄质可以通过PI3K/Akt通路诱导人宫颈癌HeLa细胞的凋亡[31]；可溶性玉米纤维可以通过增加ROS表达，诱导Apc缺陷的结肠癌SW480细胞凋亡，显著减少小鼠小肠腺瘤的形成和结肠息肉的数量[32]。此外，谷物豆组合膳食纤维可对Caco-2细胞葡萄糖吸收作用产生影响，并且可以改善胰岛素抵抗HepG2细胞[33]。目前尚未见谷子源膳食纤维抗肝癌活性的相关报道，本研究为谷子源可溶性膳食纤维发挥抗肝癌效应提供了一定的实验依据和理论基础，同时有效提高了谷物及谷糠资源的生物利用率。

本研究从山西特色天然产物资源全谷物、小米和谷糠中制备了三种谷子源可溶性膳食纤维，系统分析其含量和得率，结果发现小米的可溶性膳食纤维最多，其次是全谷物可溶性膳食纤维，最后是谷糠可溶性膳食纤维；我们推测其原因是源于相同质量的原材料，全谷物中小米所占的比重比小米原材料少，所以全谷物中可溶性膳食纤维的含量比小米中的少。对三种谷子源可溶性膳食纤维进行了安全性评价，结果揭示三种谷子源可溶性膳食纤维对人正常肝细胞HL-7702增殖无任何抑制作用。进一步本研究采用HepG2细胞，评价三种谷子源可溶性膳食纤维的抗肝癌活性。研究结果证明，三种谷子源可溶性膳食纤维对人肝癌HepG2细胞均具有显著的抑制作用，且谷糠可溶性膳食纤维的抗肝癌活性更强，并具有浓度依赖性。此外，采用克隆形成实验、细胞划痕实验和细胞凋亡实验证明谷糠可溶性膳食纤维可显著抑制HepG2细胞的克隆形成能力和迁移能力，并且能够通过诱导凋亡而抑制其增殖。

4 结论

本研究对山西特色产物全谷物、小米和谷糠中的可溶性膳食纤维进行提取和抗肝癌活性测定。结果显示：小米可溶性膳食纤维含量最多，其次是全谷物可溶性膳食纤维，最少的是谷糠可溶性膳食纤维；三种谷子源可溶性膳食纤维均可有效抑制肝癌HepG2细胞增殖，其中谷糠可溶性膳食纤维的抗肝癌活性最显著，并可以有效抑制克隆形成和细胞迁移、显著促进细胞凋亡。综上所述，本研究对谷子源可溶性膳食纤维对于实际生活中预防和治疗肝癌具有很好的指导意义，为肝癌的治疗提供了新的思路。未来可针对谷子源膳食纤维组成展开工作，深入探讨其发挥功能活性的单一组分，并研究其对肝癌细胞作用的分子机制及作用靶点，以期提供安全、高效的抗肝癌保健品和新型药物。