响应面法优化红豆酶解工艺的研究

余 飞

南昌泰康食品科技有限公司 (南昌 330100)

红豆呈圆柱状，种皮为暗棕红色，微有光泽，中间凹陷成一纵沟，偏向一端，颗粒物明显棱脊，较为光滑。红豆的质地偏软，对半切开，两瓣乳白色的仁亦能清晰可见。红豆的功效与作用：降脂减肥，它含有大量的天然皂角苷，人体吸入后能加快人体内过氧化脂质代谢，并抑制人体对脂肪的吸收，能起到降脂减肥的重要作用；预防癌症，红小豆中含有的皂苷和植物蛋白以及维生素E等营养成分都是天然的抗癌物质，他们不单能阻止人体细胞癌变，还能抑制癌细胞生长和扩散，它对现在人类高发的胃癌和肠癌都有明显预防作用；通乳生乳，它能补益气血，也能促进乳汁分泌，还能加快女性产后身体恢复；预防高血压和高血脂，其含有的微量元素和维生素被人体吸收以后，能直接作用于人类的心血管，它既能增加毛细血管通透性，又能提高血管壁的韧性和弹性，能促进血液循环，稳定血压和血脂，并能降低血栓和动脉硬化以及冠心病的发病率[1-3]。

红豆含有21%的蛋白质，以及64%的碳水化合物，主要为淀粉，在制作红豆饮料过程中，红豆中淀粉糊化，淀粉在冷水中使水膨胀，遇热后水分子从淀粉粒内部，使淀粉粒继续膨胀，其体积可增大至几倍至几十倍，最后破裂变为粘稠的胶体溶液，此现象称为糊化。红豆糊化后，状态均匀，口感细腻光滑。但是，随着饮料储存时间的加长，糊化后的淀粉已经展开的散乱的胶束分子会收缩靠拢，于是淀粉制品由软变硬，返生老化。淀粉老化后，淀粉与水失去亲和力，难以复水，食品会失去口感，饮料会慢慢形成凝胶状，像豆腐块一样，同时口感变得粗疏[4-5]。

生物酶解技术，就是利用生物酶催化的酶促反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶(通常是水解酶)，将聚合物形式的生物大分子分解为其组成成分单体的技术。生物酶解技术具有反应单一、反应条件温和、反应效率高、不存在或极少存在逆反应的优点。在饮料制备工艺中，我们最常用的酶制剂主要是α-淀粉酶、β-淀粉酶。淀粉被淀粉酶水解后的产物是麦芽糖、葡萄糖。其中a淀粉酶作用的结果，可以将长的糖链切割成短链，即形成相对分子质量较小的糊精。β-淀粉酶作用的结果是切下两个葡萄糖单位，即麦芽糖，a-1，6糖苷酶作用结果就是切下侧链，形成直链糖。淀粉水解后，形成的麦芽糖、葡萄糖等小分子化合物，能快速的被人体所吸收，同时也降低了产品分层、析水、淀粉老化现象。

本试验采用α-淀粉酶酶解红豆原料，并应用响应面分析法(RSM)[6]来优化酶解工艺，以最终产品DE值为基准，最后通过喷雾干燥技术制备得到红豆粉。

1 材料和方法

1.1 材料及设备

1.1.1材料与试剂

红小豆，安徽燕之坊食品有限公司；α-中温淀粉酶，诺维信(中国)生物技术有限公司；3,5-二硝基水杨酸，分析纯，启东市名成化工有限公司；氢氧化钠，分析纯，广州豪霸化工科技有限公司；丙三醇，分析纯，郑州福佑德化工产品有限公司；葡萄糖，分析纯，大连美仑生物技术有限公司。

1.1.2主要仪器

恒温水浴锅，江苏金坛市中大仪器厂；60-6S型均质机，上海东华高压均质机厂；JM30型胶体磨，温州市鹿城精益胶体磨厂；LPG-5型喷雾干燥器，常州品正干燥设备有限公司；721型分光光度计，山东高密彩虹分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1红豆酶解工艺流程

红豆→蒸煮→胶磨→酶解→过筛→均质→灭酶→喷雾干燥→包装→质检→成品

(1)原料的选择

选择的红小豆颗粒都饱满，色泽红润。

(2)胶磨

红小豆粒清洗干净后，加水煮沸至开裂，然后加入小苏打，加盖闷30 min，最后打浆后过二遍胶体磨。

(3) 酶解

胶磨后的红豆浓浆温度下降到60 ℃后，加入a-中温淀粉酶(底物干基的百分比)，搅拌均匀，恒温保持60～100 min。

(4)均质

红豆酶解后，35 MPa均质，均质后料液呈稀湖状，具有流动性为佳，然后再煮沸灭酶10 min，杀灭红豆料液中的酶活性。

(5)喷雾干燥

以进风温度160 ℃，出风温度75 ℃，进行喷雾干燥，粉末过100目，制得成品。

(6)检验

对成品的理化指标(蛋白质)和卫生指标(细菌总数、大肠菌群数)进行检测，两者均合格后方能入库。

1.2.2测定方法

采用DNS法测定DE值[7-8]。

还原糖标准曲线的绘制：以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。

图1 DNS标准曲线

1.2.3影响红豆酶解工艺的单因素试验

1.2.3.1 不同酶添加量对红豆酶解工艺的影响

在红豆含量12%、酶解温度60 ℃、酶解时间80 min、小苏打添加量0.05%(底物干基的百分比)条件下，酶添加量(底物干基的百分比)分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，以DE值为指标，研究不同酶添加量对红豆酶解工艺的影响。

1.2.3.2 不同酶解时间对红豆酶解工艺的影响

在红豆含量12%，酶解温度60 ℃，酶添加量0.3%(底物干基的百分比)，小苏打添加量0.05%(底物干基的百分比)条件下，酶解时间分别为20 min、40 min、60 min、100 min、120 min，以DE值为指标，研究不同酶解时间对红豆酶解工艺的影响。

1.2.3.3 不同小苏打添加量对红豆酶解工艺的影响

在红豆含量12%，酶解温度60 ℃，酶添加量0.3%(底物干基的百分比)，酶解时间80 min条件下，小苏打添加量(底物干基的百分比)分别为0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%，以DE值为指标，研究不同小苏打添加量对红豆酶解工艺的影响。。

1.2.4响应面法试验设计

在单因素试验基础上，根据Box -Benhnken 模型的中心组合试验设计原理选取酶添加量、酶解时间、小苏打添加量为自变量, 以料液DE值为响应值设计响应面试验。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1不同酶添加量对红豆酶解工艺的影响

由图2可知，加入中温淀粉酶为0.1%的时候，红豆淀粉含量较高，使得酶制剂能快速与淀粉相结合，产生酶解反应，但由于酶制剂添加量不多，同时底物淀粉含量偏多，两者之间的量比不同，所以反应程度很有限，DE值偏低。当酶制剂添加到0.3%的时候，红豆中淀粉全部被酶解，产生大量的麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等。后期即使酶添加量达到0.4%～0.5%，由于其反应底物不够，因此酶解的程度不会发生太大的变化。考虑到酶制剂成本，添加0.3%的淀粉酶，酶解工艺最合理。

2.1.2不同酶解时间对红豆酶解工艺的影响

由图3可知，反应时间在20 min时，由于红豆中淀粉与酶制剂接触反应的时间不够，只有部分淀粉被分解成麦芽糖、葡萄糖等，因此DE值整体偏低。当淀粉与酶制剂充分反应的时候，即反应时间80 min的情况下，不管是直接淀粉或者支链淀粉被水解的程度都比较彻底。随着酶解反应时间的加长，由于反应底物基本上都已经被酶解，继续酶解不会产生多余的还原糖，因此DE值变化幅度不是很大。考虑到工艺成本，反应时间80 min最为合理。

图2 不同酶添加量对DE值的影响

图3 不同酶解时间对DE值的影响

2.1.3不同小苏打添加量对红豆酶解工艺的影响

由图4可知，在红豆蒸煮过程中，加入小苏打，一方面可以保护红豆中的蛋白，另一方面，有助于红豆中淀粉能释放出来，方便于后期的酶解反应。当小苏打添加量为0.05%的时候，淀粉被释放的差不多，此时的程度最有利于酶解反应。如果继续添加小苏打，一方面会加大物料的成本投入，另外会影响到最终产品的酸碱度，进而会产生不愉悦的口感。

图4 小苏打添加量对DE值的影响

2.2 响应面试验结果

在单因素试验基础上，根据Box -Benhnken 模型的中心组合试验设计原理选取酶添加量、酶解时间、小苏打添加量为自变量, 分别以X1、X2、X3来表示, 并以+1、0、- 1 分别代表自变量的高、中、低水平。按方程xi=(Xi-X0)/ΔX对自变量进行编码，料液DE值为响应值，试验因素及水平设计见表1，试验安排及结果见表2。

表1 响应面法分析因素及水平

表2 响应面法试验结果

实验号X1 X2X3DE值/%610-133.57-10132.6810135.590-1-136.81001-136.5110-1137.91201137.61300045.21400043.51500041.81600041.51700043.9

应用Design Expert 软件，对表2中的数据进行多元回归拟合， 选择对响应值显著的各项, 可得酶添加量(X1)、酶解时间(X2) 和小苏打添加量(X3)与DE值(R1)之间的二次多项回归方程:

R1=43.18-0.9X1-0.89X2-0.66X3+2.88X1X3-3.19X12-1.92X22-4.06X32

方差分析如表3所示，由此可以看出红豆酶解工艺实验所选用模型合理，而且拟合优度好，通过了显著性检验，相关系数R=0.999 6,仅有约1%的变异不能由该模型解释。

表3 回归模型的方差分析

由表4可以看出，本试验所建立的模型中，X1对DE值的影响显著；X12、X32极为显著。

表4 回归方程系数及其显著性检验

2.3 红豆酶解工艺的响应面分析

由回归方程所作的响应曲面图及其等高线图如图5～图7所示。影响DE值最显著因素是酶添加量(X1)，表现为等高曲线陡峭；影响较小的是小苏打添加量(X3), 表现为等高曲线较为平滑。

由图5～图7可以看出, DE值随酶添加量的上升而增加, 到达一定比例时，DE值几乎不变。通过响应面和等高线图可以看出，任何两个因素之间的协同性对DE值得影响。对模型方程求导数，并令其等于零，可以得到相应曲面的最大点，即3个主要因素的最佳取值，分别为:X1=0.04、X2=0.152、X3=-0.068, 转换后得到DE值的最佳条件为: 酶添加量0.304%，酶解时间83 min，小苏打添加量0.051%。

图5 酶添加量与酶解时间的响应面和等高线图

图6 酶添加量与小苏打添加量的响应面和等高线图

图7 酶解时间与小苏打添加量的响应面和等高线图

2.4 最佳条件的论证

为了进一步验证最优红豆酶解工艺条件，取响应面中得分较高的实验与最优条件下的实验结果对比，以最终产品DE值数为评价标准，得到表5所示。

表5 最优条件实验结果表

从表5可知，试验1、试验2和试验4的DE值最高。根据成本考虑，选择红豆酶解工艺的最佳条件为：酶添加量为0.3%，酶解时间80 min，小苏打添加量0.05%。因此，采用响应面法优化得到的红豆酶解工艺最优条件准确可靠，具有实用价值。

3 结论

实验中以DE值为酶解程度指标,对红豆酶解的条件进行了初步研究, 结果表明:酶添加量对DE值有显著影响, 而小苏打添加量对其影响较小。将响应面分析法应用于红豆酶解工艺工艺中, 通过对试验结果的分析比较, 确定了最佳固定化条件为: 酶添加量0.3%，酶解时间80 min，小苏打添加量0.05%，并在该条件下DE值达到45.4%。