基于二次通用旋转组合设计的暗紫贝母优质高产施肥研究

邓秋林，杨正明，陈 雨，文秋姝，张亚琴，李思佳，刘震东，陈兴福*

（1.四川农业大学，四川 成都 611130；2.西南民族大学，四川 成都 610041；3.青白江区农业农村局，四川 成都 610300；4.四川松赞雪贝生物科技有限公司，四川 松潘 623301）

百合科贝母属植物暗紫贝母Fritillaria unibracteataHsiao et K.C.Hsia是药材川贝母的基原植物之一，最初收载于1963版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》），以干燥鳞茎入药。其具有清热润肺、化痰止咳、散结消痈的功效；用于肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、痰中带血、瘰疬、乳痈以及肺痈等症［1］。暗紫贝母主要分布于四川省若尔盖高原和川西高山峡谷东段，包括四川阿坝州各县以及青海久治、斑玛等地，生长于海拔3200～4500 m的草甸和灌丛中［2］。暗紫贝母在中药材市场上的需求量大，但其鳞茎生长速度特别慢，从种子长成商品药材一般需要4年的时间［3］。随着药材用量的不断增加，野生资源已基本枯竭，药用暗紫贝母长期存在着供不应求的问题。只有加强暗紫贝母的栽培技术研究，才能有效满足川贝母的市场供应。目前，暗紫贝母的种植仅限于试验阶段，尚未大面积栽培。施肥是中药材种植的关键环节之一，科学合理施肥可以有效地提高中药材的产量和质量［4-5］。曹超仁等［6］发现，氮、磷、钾配施对枣果单果重和灰分有显著影响；夏贵惠［7］发现，丹参的丹酚酸类成分与丹参酮类成分积累所需的氮、磷、钾配比不同；卢挺等［8］发现氮、磷、钾的合理配施能够促进广金钱草的生长并提高产量，同时影响夏佛塔苷的积累。对暗紫贝母的研究现主要集中在成分［9-12］、药理作用［13-14］、组织培养［15-17］等方面，对大田栽培［18］尤其是施肥的研究较少。

本研究通过对暗紫贝母进行不同水平的氮、磷、钾配施处理，按照《中国药典》（2015版，第一部）川贝母项下标准，对不同施肥水平下培育的暗紫贝母质量进行研究，同时研究其对产量的影响，以期为暗紫贝母的高产优质栽培提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2016年8月至2017年10月在四川省松潘县水晶乡四川松赞雪贝生物科技有限公司川贝母标准化生产基地（103°42′E，32°57′N）进行，该地区年平均温度6℃，年平均降水量730 mm，无霜期80 d。试验地土壤pH 5.74，有机质161.00 g/kg，碱解氮914.66 mg/kg，有效磷14.58 mg/kg，速效钾88.89 mg/kg。

1.2 试验材料

供试材料为4年生暗紫贝母，由四川省松潘县水晶乡四川松赞雪贝生物科技有限公司川贝母标准化生产基地提供，经四川农业大学陈兴福教授鉴定为百合科贝母属植物暗紫贝母（F.unibracteataHsiao et K.C.Hsia）。

1.3 试验设计

试验研究采用三因素五水平二次回归通用旋转组合设计，设置氮肥（尿素，N 46%）、磷肥（过磷酸钙，P2O512%）、钾肥（硫酸钾，K2O 45%）3个因素，5个水平，共20个小区，各因素编码水平见表1，实施方案见表2。暗紫贝母于2016年8月栽种，小区面积3 m×1 m=3 m2，株距10 cm，行距15 cm，每个小区栽种贝母鳞茎180粒，贝母鳞茎大小为12 mm。在栽培前施用15000 kg/hm2的农家肥作为底肥。后期除肥料施用外，其他处理与基地管理一致。氮肥、磷肥和钾肥均作追肥施用，分别在暗紫贝母齐苗期、开花期和挂果期施用，用量分别为总量的20%、35%和45%。

表1 因素水平编码表 （kg/hm2）

表2 试验设计与实施方案

1.4 测定项目及方法

1.4.1 暗紫贝母产量的测定

于2017年8月6日，在暗紫贝母植株地上部分完全倒苗后进行采挖，分别按照试验小区编号测定产量，并折算成每公顷的产量。

1.4.2 暗紫贝母总灰分的测定

总灰分的测定参照《中国药典》（2015版，第四部）［19］通则2302项下的相关方法进行测定。

1.4.3 暗紫贝母浸出物的测定

浸出物的测定参照《中国药典》（2015版，第四部）［19］通则2201项下的热侵法进行测定，使用50%乙醇进行浸提。

1.4.4 暗紫贝母总生物碱的测定

总生物碱的测定参照《中国药典》（2015版，第一部）［1］川贝母项下的总生物碱含量的提取和测定方法进行测定。

对照品溶液的制备：精密称取西贝母碱对照品1.8 mg，用三氯甲烷溶解定容至25 mL，即得质量浓度0.072 mg/mL的标准品溶液。

标准曲线的绘制：精密量取对照品溶液0、0.3、0.6、1.2、1.8、3.0 mL，置于25 mL具塞试管中，分别补加三氯甲烷至10.0 mL，精密加水5 mL、再精密加0.05%溴甲酚绿缓冲液（取溴甲酚绿0.05 g，用0.2 mol/L氢氧化钠溶液6 mL使其溶解，再加入磷酸二氢钾1 g，加水使其溶解并稀释至l00 mL，即得）2 mL，密塞，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白，用酶标仪在415 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称本品粉末1.000 g，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液1.5 mL，浸润1 h，加三氯甲烷-甲醇（V∶V=4∶1）混合溶液20 mL，置80℃水浴加热回流2 h，放冷，滤过，滤液置25 mL量瓶中，用适量三氯甲烷-甲醇（V∶V=4∶1）混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（V∶V=4∶1）混合溶液至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置25 mL具塞试管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使其溶解，按照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加水5 mL”起，依此方法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中西贝母碱的重量（mg），计算，即得。

1.5 数据分析

根据所测得的数据，使用Excel 2010进行数据的换算和处理，利用DPS 7.05数据处理系统对数据进行回归模型的建立和分析，最终用Excel 2010制图和分析。

2 结果与分析

2.1 模型的建立与检验

使用DPS 7.05对试验结果进行回归分析，分别得到产量（Y1）、总灰分（Y2）、浸出物（Y3）、总生物碱（Y4）与N（X1）、P2O5（X2）、K2O（X3）的回归模型。用F检验法分别检验方程各项回归系数、方程总回归系数和失拟度，得到方差分析表（表3）。

表3 方差分析结果

由表3可知，方程Y1、Y2、Y3、Y4的FLf均不显著，说明模型能真实反映暗紫贝母产量、总灰分含量、浸出物含量、总生物碱含量与氮、磷、钾肥之间的相互关系；方程Y1、Y2、Y3、Y4的FR均达到了0.05显著水平，说明方程Y1、Y2、Y3、Y4的模型成立，方程与实际情况拟合程度较好。为了提高回归方程的稳定性，增强预测效果，对其各回归系数进行显著性检验，剔除0.10显著水平下不显著的项后，得到优化的回归方程Y1′、Y2′、Y3′和Y4′。

2.2 模型分析

2.2.1 主效应分析

利用表3中各项回归系数的F值计算各因素对因变量的贡献率，由此可知各因素对产量、总灰分含量、浸出物含量、总生物碱含量影响的大小。使用贡献率计算公式计算，分别得到各因素对暗紫贝母产量和质量的贡献率（表4）。

表4 单因素贡献率

由表4可知，各因素对暗紫贝母的产量、总灰分、浸出物、总生物碱的影响不同。各因素对产量和总灰分的影响大小为K2O＞N＞P2O5，对浸出物和总生物碱的影响大小为N＞P2O5＞K2O。结果表明K2O对产量和总灰分的影响最大，P2O5对产量和总灰分的影响最小，N处于中间调控的地位；N对浸出物和总生物碱的影响较大，其次是P2O5，K2O对浸出物和总生物碱的影响最小。

2.2.2 单因素效应分析

由表3可知，N、P2O5、K2O对总灰分有显著影响，N对总生物碱有显著影响。由此分别计算出N、P2O5、K2O对总灰分、总生物碱的单因素效应方程，再由方程可得单因素图（图1）。

图1 单因素效应分析

由图1A可知，随着N用量的增加，总灰分呈逐渐降低的趋势；随着P2O5用量的增加，总灰分呈逐渐升高的趋势；随着K2O用量的增加，总灰分呈先升高后降低的趋势，在-1.682水平含量最低。由图1B可知，随着N用量的增加，总生物碱含量呈先降低后升高的趋势，在1.682水平，总生物碱含量最高。说明高水平的N有利于暗紫贝母总灰分的降低，P2O5、K2O的施用会升高总灰分，高水平的N有利于总生物碱含量的升高。

2.2.3 互作效应分析

由表3可知，P2O5、K2O互作对产量有显著影响，N、P2O5互作对浸出物有较显著的影响。使用降维法固定单因子为零，可得到P2O5-K2O互作对产量和N-P2O5互作对浸出物的效应方程，再分别作互作的效应图（图2）。

图2 互作效应

由图2可知，在K2O处于较高水平时，随着P2O5的增加，产量越来越高；在P2O5处于较高水平时，随着N的增加，浸出物含量越来越高。说明P2O5-K2O互作对产量有协同效应，N-P2O5互作对浸出物含量有协同效应。低P2O5低K2O或高P2O5高K2O均有利于暗紫贝母产量的形成，为理想的互作区间，同理，低N低P2O5或高N高P2O5均有利于增加暗紫贝母的浸出物含量。

2.3 暗紫贝母高产优质方案分析

考虑到实际生产时存在土壤、气候环境差异的影响，通过使用统计频数法进行分析可以得到一个合适的高产范围以及高总生物碱含量范围的最优配施方案，其中总生物碱为暗紫贝母的指标性成分，因此设置产量≥459.18 kg/hm2为高产，总生物碱含量≥0.07%为优质。

由表5、6可知，当施用N 138.33～190.77 kg/hm2、P2O5541.75～720.25 kg/hm2、K2O 337.49～454.52 kg/hm2时，产量可达459.18 kg/hm2；施用N 163.82～217.14 kg/hm2、P2O5524.13～737.88 kg/hm2、K2O 335.84～456.16 kg/hm2时，总生物碱含量可达0.07%及以上。因此，当施用N 163.82～190.77 kg/hm2，P2O5541.75～720.25 kg/hm2，K2O 337.49～454.52 kg/hm2时，产量可达459.18 kg/hm2，总生物碱含量可达0.07%及以上。

表5 产量≥459.18 kg/hm2的频率分布及农艺措施

表6 总生物碱含量≥0.07%的方案频数分布

2.4 基于灰色关联度和DTOPSIS法综合评价暗紫贝母产量和质量

为了利用暗紫贝母的各项指标对暗紫贝母整体做出一个客观评价，本研究综合了产量、总灰分、浸出物、总生物碱，使用灰色关联度法计算出各参评材料的权重值和灰关联度ri，并进行排序，使用灰关联权重值进行了DTOPSIS法处理，得到DTOPSIS法的相对接近度值Ci及其排序（表7）。总灰分是中药材经加热炽灼灰化遗留下的无机物，灰分含量过高可能含有其他无机物，因此总灰分越低越好。

由表7可知，采用灰色关联度法和DTOPSIS法的综合评价结果一致。2种方法所得综合表现最优的是处理10，即当N 329 kg/hm2、P2O5631 kg/hm2、K2O 396 kg/hm2时暗紫贝母的产量和质量综合最优。由表7可知灰色关联度法所得关联度最大差异为19.75%，DTOPSIS法所得Ci值最大差异可达66.05%，DTOPSIS法能够更好地区分材料的优劣。

表7 待评价材料的加权关联度ri与Ci排序值比较

3 结论与讨论

本试验应用二次通用旋转组合设计，建立了暗紫贝母产量与质量指标的数学模型，通过对模型的分析，K2O对产量和总灰分的影响最大，N对浸出物和总生物碱的影响最大；通过暗紫贝母高产优质方案分析、灰色关联度和DTOPSIS法综合评价暗紫贝母产量和质量，同时结合实际应用价值，本试验得到的暗紫贝母高产优质的施肥方案为N 163.82～190.77 kg/hm2、P2O5541.75～720.25 kg/hm2、K2O 337.49～454.52 kg/hm2。

合理施肥能够有效提高药用植物的产量和促进药用植物有效成分的累积［20］。大量研究表明对根类药材产量影响较大的是氮肥［21-23］，在本研究中，钾肥对暗紫贝母的产量影响最大，一方面可能是因为土壤的速效氮含量高，再施加氮肥作用不大，同时氮肥的过量施用会使地上部分徒长，地下部分产量减低；另一方面钾肥的施用能促进麦冬的干物质积累，并有利于碳水化合物向根部运输和积累，促进植株对氮、钾的吸收［20］。李琼芳等［24］的研究结果也表明氮、磷、钾肥对川麦冬产量的影响大小为钾肥＞氮肥＞磷肥。低磷低钾或高磷高钾均有利于暗紫贝母产量的形成，在张浩等［25］的研究中，高产处理黄连养分含量根茎以低氮低钾（磷）为主。氮、磷、钾肥配施会影响药材中灰分、浸出物以及有效成分的含量［26-28］。在氮肥和钾肥用量一定时，随着磷肥用量的增加，枣果的灰分增加；在氮肥和磷肥用量一定时，随着钾肥用量的增加，枣果的灰分先升高后降低［4］。氮肥的施用可以降低暗紫贝母总灰分含量，钾肥对总灰分含量的影响最大。在本研究中随着氮肥用量的增加，总生物碱含量呈先降低后升高的趋势，氮肥对生物碱的影响最大，其次为磷，然后是钾，这与张燕等［29］得到的各元素对水苏碱的影响大小相同。氮是生物碱的有机组成部分之一，因此其对生物碱的合成影响较大。