双参数MRI纹理分析参数及血清miR-141-3p水平与早期前列腺癌患者腹腔镜根治术后骨转移的关系▲

王 昆 吴晓琼 郑小令 沈长青

(海南省儋州市人民医院放射科，海南省儋州市 571700)

前列腺癌根治术是治疗早期前列腺癌患者的主要方式，可有效切除癌变组织，减轻肿瘤负荷，提高患者的生存质量[1]。腹腔镜前列腺癌根治术具有创伤小、术后并发症少、恢复快等优点，近年来被广泛用于前列腺癌患者的治疗，且取得良好效果；但早期前列腺癌患者经根治术治疗后仍存在骨转移、复发等风险，这不利于患者预后[2]。因此，寻求可评估早期前列腺癌患者根治术后骨转移风险的指标至关重要。目前，临床上评估前列腺癌骨转移的常见方式包括X线、CT、MRI、骨扫描等，其中MRI分辨率较高，临床应用较多[3]。T2WI及扩散加权成像(diffusion weighted imaging，DWI)组合的双参数MRI(biparametric MRI，bpMRI)现已被用于前列腺癌的诊断及预后评估，且被证实可提高诊断效能和预后评估效能[4]。纹理分析是一种图像处理技术，该技术可评估图像信号的异质性，提高诊断准确率，对评估前列腺癌分级有一定意义[5]。miRNA的异常表达与肿瘤发生、发展均有密切关系，研究表明miR-141-3p可抑制前列腺癌细胞的增殖与迁移[6]。由此我们推测血清miR-141-3p可能与前列腺癌术后骨转移有关。虽然已有学者在前列腺癌患者中分别进行关于bpMRI纹理分析、血清miR-141-3p表达水平的研究，但将二者联合用于评估前列腺癌根治术后骨转移的研究较少。因此，本研究探讨术前bpMRI纹理分析参数、血清miR-141-3p表达水平与早期前列腺癌患者腹腔镜根治术后骨转移的关系，以及二者的预测价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2016年4月至2018年4月在我院进行腹腔镜根治术治疗的82例早期前列腺癌患者的临床资料，根据术后3年内发生骨转移的情况分为转移组41例与未转移组41例。纳入标准：(1)早期前列腺癌的诊断符合《前列腺癌临床诊断与治疗：从指南到临床》[7]中的标准，经直肠指检、前列腺活检等检查确诊；(2)均为初诊患者，既往未接受过其他方式治疗；(3)术后均随访3年；(4)病历资料完整。排除标准：(1)合并肺癌、肝癌等其他恶性肿瘤者；(2)bpMRI图像质量较差，病变显示不清楚者；(3)合并重要脏器严重疾病(如肝肾功能衰竭)者；(4)确诊时已存在骨转移者；(5)随访期间死亡者。本研究经我院医学伦理委员会审批通过。

1.2 手术治疗的方法 全部患者均接受腹腔镜前列腺癌根治术治疗。采用气管插管全身麻醉，取头低脚高仰卧位。经腹膜外入路进行手术，采用5孔法，按照Montsouris七步法进行手术，取出标本、彻底止血后放置盆腔引流管，缝合、术毕。

1.3 随访方式 随访主要以电话与门诊方式为主。术后第1年患者每3个月到院复查1次；术后第2～3年，患者每6个月到院复查1次，每周进行电话随访。复查内容主要包括检测肿瘤标志物、MRI，如MRI检查提示存在骨盆骨质异常信号则需进一步行单光子发射计算机断层成像/PET-CT检查，观察患者术后转移及复发等情况。

1.4 骨转移的诊断标准 采用Infinia Ⅱ Hawkeye 单光子发射计算机断层成像/PET-CT显像仪(美国GE公司)进行全身骨显像检查。检查前嘱咐患者排空膀胱，摘除身上金属物品，取仰卧位。经肘静脉注入显像剂99Tcm-MDP 740 Mbq(上海原子科兴药业有限公司)0.1 mmol/kg，注射速率为2～3 mL/s，30 min后饮水1 000～1 500 mL，2～3 h后进行前后位、后前位的全身骨显像。参数设置：能峰140 KeV，窗宽20%，矩阵256×1 024，速度10～20 cm/min。符合以下标准中任一项即为骨转移[8]：(1)病变处放射性分布较对侧及临近骨组织异常升高或下降；(2)骨组织中有1个以上可疑病灶，在随访中可见病灶增大呈明显进展。

1.5 基线资料的收集 基线资料包括年龄、临床分期[9](Ⅰ期、Ⅱ期)、合并高血压(收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg)情况、合并糖尿病(空腹血糖≥7 mmol/L 或OGTT后2 h的血糖≥11.0 mmol/L)情况、体质指数、肿瘤直径等。

1.6 bpMRI纹理分析 术前1周采用飞利浦3.0T Ingenia型MRI扫描仪、16通道体部相控阵线圈进行检查。横断位T2WI参数：重复时间为5 202 ms，回波时间为100 ms，视野为200 mm×200 mm，矩阵为256×205，层厚为4 mm，层间距为0.8 mm，激发次数1次，回波链13；横断位DWI参数：重复时间为3 700 ms，回波时间为80 ms，视野为260 mm×221 mm，矩阵为160×95，层厚为4 mm，无层间距，激发次数4此，B值(弥散敏感因子)=0 s/mm2、100 s/mm2、800 s/mm2。导出原始图像数据后在仪器自带软件中勾画兴趣区，由两名经验丰富的医学影像科副主任医师采用盲法在T2WI、DWI序列中勾画层面所有病灶区为感兴趣区，利用软件提取感兴趣区纹理特征，获取纹理参数，包括感兴趣区的熵、偏度、峰度等。

1.7 血清学指标的检测方法 术前1 d采集患者空腹状态下外周肘静脉血6 mL，采用德国Eppendorf公司的TDZ4型离心机以3 000 r/min的速率离心15 min(离心半径10 cm)，将获得的血清分别置于两支试管中保存，放置于-80 ℃环境中保存待检。取其中一支试管，采用ELISA测定血清前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)水平，试剂盒由美国R&D公司提供(批号：150412)，操作严格遵照试剂盒说明书进行。取另一支试管，采用实时荧光定量PCR检测血清miR-141-3p mRNA表达水平：采用TRIzol[购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，批号：50175111]方法提取血清总RNA，利用紫外分光光度计(梅特勒-托利多国际有限公司，型号：UV5)检测其浓度及纯度；采用反转录试剂盒(美国Invitrogen公司，批号：150204)将总RNA反转录为cDNA，置于-20 ℃保存待检；miR-141-3p(日本Takara宝生物工程有限公司提供)上游引物序列(5′-3′)为ACCCAGTGCGATTTGTCA，下游引物序列(5′-3′)为ACTGTACTGGAAGATGGACC；内参U6上游引物序列为5′-CTACGATCGTACGTGTA-3′，下游引物序列为5′-AGCTCGAGAGTCTGTAT-3′。配制反应体系，包括SYBR Green Ⅰ混合液20 μL、cDNA 4.0 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、无RNA酶水5.0 μL，混匀以上体系后瞬时离心，置于9700型PCR仪(美国ABI公司)中进行反应，反应条件为95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，40个循环。实验进行3次取平均值，以U6作为内参，采用2-ΔΔCt法计算血清miR-141-3p的相对表达水平。

1.8 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计数资料以例数和百分比表示，组间比较采用χ2检验；等级资料的比较采用秩和检验；计量资料均经Shapiro-Wilk法进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，偏态分布的资料以[M(P25，P75)]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验；采用Logistic回归模型分析血清学指标与前列腺癌患者术后骨转移的关系；绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，并计算曲线下面积(area under the curve，AUC)，AUC值>0.9表示预测性能较高，>0.7～0.9表示有一定预测性能，>0.5～0.7表示预测性能较差。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者基线资料和血清学指标的比较 转移组患者术前血清PSA水平与血清miR-141-3p表达水平均高于未转移组(均P<0.05)，而两组间其他基线资料差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 两组患者基线资料和血清学指标的比较

续表1

2.2 血清miR-141-3p表达水平、PSA水平与前列腺癌根治术后骨转移的关系 将术后骨转移状况作为因变量(1=转移，0=未转移)，患者术前血清miR-141-3p表达水平、血清PSA水平作为自变量(均为连续变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，术前血清miR-141-3p表达水平、血清PSA水平升高可能与前列腺癌根治术后骨转移有关(均OR>1、P<0.05)。见表2。

表2 Logistic回归分析结果

2.3 两组患者bpMRI纹理分析参数的比较 两组患者表观弥散系数(apparent diffusion coefficient，ADC)峰度、T2WI峰度比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；转移组患者ADC熵、T2WI熵、ADC偏度、T2WI偏度均高于未转移组(均P<0.05)。见表3。

表3 两组患者bpMRI纹理分析参数的比较

2.4 术前bpMRI纹理分析参数联合血清miR-141-3p表达水平评估前列腺癌根治术后骨转移风险的价值 将前列腺癌根治术后骨转移状况作为状态变量(1=转移，0=未转移)，将患者术前血清miR-141-3p表达水平、ADC熵、ADC偏度、T2WI熵、T2WI偏度作为检验变量，绘制ROC曲线图(见图1)，并通过Logistic回归模型建立联合预测指标。结果显示，当术前血清miR-141-3p表达水平、ADC熵、ADC偏度、T2WI熵、T2WI偏度的截断值分别取2.68、5.87、0.76、5.46、0.64时，可获得最佳评估价值，均有一定的预测效能；而术前bpMRI纹理分析参数(ADC熵、ADC偏度、T2WI熵、T2WI偏度同时纳入)联合血清miR-141-3p表达水平的AUC高达0.976，预测效能较高，见表4。

图1 术前bpMRI纹理分析参数、血清miR-141-3p表达水平单独及联合评估前列腺癌根治术后骨转移风险价值的ROC曲线

表4 术前bpMRI纹理分析参数和血清miR-141-3p表达水平单独及联合预测前列腺癌患者术后骨转移风险的价值

3 讨 论

对于早期前列腺癌患者，采用腹腔镜前列腺癌根治术治疗虽然可以精准切除肿瘤病灶、延长患者的生存时间，但术后肿瘤转移仍是导致患者预后不良的关键因素，其中以骨转移最为常见[10]。因此，寻求可以准确评估前列腺癌患者术后骨转移的指标成为近年研究的重点。

影像学检查是评估前列腺癌骨转移的重要手段。bpMRI是近年来临床上常用于评估前列腺癌转移的非侵入性检查手段，参数主要包括DWI与T2WI，其中DWI是bpMRI的重要组成序列之一，其定量参数ADC可量化评估水分子扩散速度，在评估前列腺癌的分化及浸润程度中具有较高价值[11]。纹理分析可用于评估肉眼不可见的图像异质性，能够从图像中提取大量信息，可用于肿瘤的诊断及恶性程度分级等[12]。峰度、熵、偏度均是bpMRI纹理分析的常用参数，其中熵主要反映整体信号的非均匀程度或复杂程度，熵值越大表示图像纹理越不规则；峰度描述感兴趣区直方图的平坦度，峰度越大表示越平坦；偏度主要描述感兴趣区直方图的不对称性，偏度越大表示测值越不稳定[13]。有学者提出，bpMRI纹理分析对于评估前列腺癌的分化积度及进展情况具有积极意义，推测bpMRI纹理分析参数可能与前列腺癌患者的术后骨转移有关[14]。本研究结果也显示，转移组患者ADC熵、T2WI熵、ADC偏度、T2WI偏度均高于未转移组(均P<0.05)，ROC曲线分析结果提示ADC熵、ADC偏度、T2WI熵、T2WI偏度的AUC在0.7～0.9之间，表明这些参数对前列腺癌术后骨转移均具有一定的预测效能， 这进一步验证了上述观点。但仅通过影像学检查结果预测前列腺癌术后骨转移结果的准确度较低，联合实验室血清学检查或可提高其评估价值。

前列腺发生炎症或癌变时，导管系统屏障受损，导致PSA释放入血，因此血清PSA水平会异常升高[15]。研究报告，前列腺癌骨转移患者的血清PSA水平显著高于无转移者[16]。虽然血清PSA水平已被证实与前列腺癌骨转移密切相关，但血清PSA水平用于评估前列腺癌时也有一定的局限性，如前列腺炎、前列腺增生等患者的血清PSA水平也会异常升高，评估前列腺癌转移的特异性不高[17]。因此，还需寻求其他可评估前列腺癌患者术后骨转移的特异性方法。本研究结果显示，转移组患者术前血清PSA水平高于未转移组(P<0.05)，进一步行回归分析显示，术前血清PSA水平升高可能与前列腺癌根治术后骨转移有关(P<0.05)，miR-141-3p或可成为早期评估前列腺癌根治术后骨转移的重要标志物。

近年来，关于miR-375、miR-141、miR-34a等多种miRNA与前列腺癌发生、发展关系的研究较多[18]。miR-141作为miR-200家族成员，与卵巢癌、结肠癌等恶性肿瘤浸润及转移等密切相关，且在前列腺癌组织中的表达显著升高[19]。miR-141-3p具有促进前列腺癌细胞侵袭及转移的能力，是前列腺癌骨转移的有效分子标记物，且与骨转移程度具有一定关系[20]。因此，我们推测术前血清miR-141-3p表达水平可能与前列腺癌根治术后骨转移有关。

本研究结果显示，转移组患者术前血清miR-141-3p表达水平高于未转移组(P<0.05)，且Logistic回归分析显示，术前血清miR-141-3p 表达水平是前列腺癌根治术后骨转移的风险因子(均P<0.05)，说明术前血清miR-141-3p过表达与前列腺癌根治术后骨转移有关。其原因可能为：miR-141-3p过表达使得肿瘤细胞大量增殖、迁移及侵袭能力增强，并发生上皮间质转化，导致肿瘤细胞迁移至骨微环境中，进而促进破骨细胞分化及骨转移灶形成，从而增加术后骨转移风险[21]。此外，miR-141-3p可激活p38蛋白激酶的磷酸化及信号通路，促进成骨活性基因表达，升高骨保护素水平，为前列腺癌骨转移微环境的形成奠定基础，增加术后骨转移风险[22]。ROC曲线分析结果提示，术前血清miR-141-3p表达水平的AUC为0.871，表明其对前列腺癌根治术后骨转移具有一定的预测效能；而将bpMRI纹理分析参数与血清miR-141-3p表达水平联合预测前列腺癌根治术后骨转移时，AUC高达0.976，预测效能较高。这表明，今后临床上可考虑将bpMRI纹理分析参数与血清miR-141-3p联合用于前列腺癌根治术后骨转移的评估中。但目前关于miR-141-3p在前列腺癌根治术后骨转移中的具体作用机制尚未明确，且未分析bpMRI纹理分析所有参数与miR-141-3p联合用于评估前列腺癌根治术后骨转移的价值，具体结论还需今后进一步研究证实。

综上所述，早期前列腺癌患者术前bpMRI纹理分析参数、血清miR-141-3p表达水平与其腹腔镜根治术后骨转移有关，二者均对术后骨转移具有一定的预测价值，且二者联合应用时更进一步提高预测效能。