ICU医院获得性MRSA肺炎患者的菌株耐药基因分析及利奈唑胺和万古霉素的治疗效果▲

房东东 杨逢永 李学军 段崇浩 孙燕洁 亓永杰 刘 亮 杨兴菊

(山东省济南市人民医院重症医学科，山东省济南市 271199)

医院获得性肺炎(hospital-acquired pneumonia，HAP)作为仅次于癌症和脑血管疾病之后的第三大类致死病因，受到临床的广泛关注[1]。研究表明，金黄色葡萄球菌是HAP最常见的致病菌，在医院获得性感染致病菌中约占20%，且分离出的金黄色葡萄球菌中约60%是耐甲氧西林的菌株，即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)[2-3]。近年来，随着耐药基因研究的深入，MRSA耐药基因受到广泛关注，但却鲜见相关的系统分析报告。为此，本研究对MRSA的耐药情况和耐药基因进行了分析。

以往临床上大多采用万古霉素治疗MRSA肺炎，疗效尚可，但随着多重耐药金黄色葡萄球菌的出现，MRSA肺炎的病死率逐渐升高[4]，这对HAP的治疗提出了新的挑战。利奈唑胺作为新一代全合成的噁唑烷酮类抗生素，其对MRSA等多种耐药菌引发的HAP均有较好的疗效[5]。为此，本研究比较了利奈唑胺与万古霉素治疗医院获得性MRSA肺炎的效果，旨在为临床治疗医院获得性MRSA肺炎提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取济南市某三甲医院ICU 2016年1月至2019年12月收治的410例继发MRSA肺炎患者作为研究对象。纳入标准：(1)HAP的诊断符合美国胸科协会制定的相关标准[6]；(2)痰培养及药敏实验结果显示MRSA者；(3)年龄>18岁者。排除标准：(1)合并其他感染者；(2)合并恶性肿瘤或自身免疫性疾病者；(3)合并器官衰竭或休克者。采用随机数字表法将患者分为对照组和观察组，各205例。其中，对照组男性92例、女性113例，年龄22～65(43.52±10.24)岁；急性生理学与慢性健康状况评分[3](20.68±6.04)分；观察组男性95例、女性110例，年龄21～67(44.75±9.82)岁；急性生理学与慢性健康状况评分(21.04±5.64)分。两组患者的上述一般资料比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究通过我院医学伦理审查委员会审核批准，并取得研究对象知情同意。

1.2 药物敏感试验及基因检测

1.2.1 体外药物敏感性试验：采用纸片扩散法进行体外药物敏感性试验[7]，评估除MRSA菌株外，药敏结果中对利奈唑胺、万古霉素、替加环素、奎奴普汀、利福平、克林霉素、庆大霉素、红霉素、四环素、青霉素、苯唑西林、环丙沙星、头孢西丁、复方磺胺甲噁唑等药物的耐药情况。

1.2.2 耐药基因检测：采集患者清晨痰液样本1 mL，离心10 min后分离、纯化，获得菌株。取2～3个新鲜菌落溶解于200 μL无菌双蒸水中，混匀配成细菌悬液，100 ℃煮沸10 min后置于碎冰中冷却10 min，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，取上清液即可获得细菌DNA模板。参照文献[7]设计相关耐药基因PCR引物，引物序列见表1。PCR反应体系包括稀释后的DNA模板2 μL、2×Power SYBR Green Master Mix 10 μL、上下游引物各1 μL，加蒸馏水至总体积20 μL。PCR扩增条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，40个循环；72 ℃ 10 min。得到反应产物后进行基因测序。涉及的仪器和试剂包括7300定量PCR仪(美国ABI公司)，Gel DocXR凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)，2% NaCl M-H琼脂平板(法国生物梅里埃公司)，LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ(瑞士Roche公司)。

表1 PCR引物序列

1.3 治疗方法和观察指标

1.3.1 治疗方法：所有患者均接受止咳化痰、调节电解质平衡、营养支持等对症支持治疗。对照组患者静脉滴注盐酸去甲万古霉素治疗(华北制药股份有限公司，国药准字H13020286)，1.0 g/次，2次/d，连续治疗14 d；观察组则静脉滴注利奈唑胺注射液(挪威 Pfizer AS，国药准字H20110311)，600 mg/次，2次/d，连续治疗14 d。

1.3.2 临床疗效的评估:(1)临床有效率。① 痊愈，指患者临床症状、体征消失，胸部X线、实验室检查及病原学等指标显著改善，基本恢复正常；② 显效，指临床表现有明显改善，但上述指标仍有1项未恢复正常；③ 有效，指临床表现有所好转，但不够明显；④ 无效，指药物治疗后临床表现无改善甚至加重。总有效率=(痊愈+显效+有效)例数/总例数×100%。(2)病原菌清除率。根据痰培养结果进行细菌学疗效评估。完全清除，指痰培养结果细菌完全转阴；未完全清除，指痰培养结果仍提示有MRSA。总清除率=完全清除例数/总例数×100%。(3)治疗期间医院内病死率。治疗期间医院内病死率=死亡人数/总人数×100%。(4)不良反应发生情况。包括恶心呕吐、头晕、腹泻、蛋白尿、血小板减少、血肌酐异常、肝功能异常等。蛋白尿指24 h测定尿白蛋白>150 mg；血小板减少指血小板计数<1010/L；血肌酐异常：血肌酐水平>133 μmol/L；肝功能异常：谷草转氨酶水平>50 U/L，谷丙转氨酶水平>45 U/L。

1.4 成本效果比分析 采用决策树模型对MRSA肺炎治疗中静脉滴注利奈唑胺和万古霉素的成本效果进行分析。决策树模型如下图1所示，当观察组利奈唑胺治疗无效或出现严重不良反应，采取万古霉素补救治疗时视为治疗失败；同样，当对照组万古霉素治疗无效或出现严重不良反应，采取利奈唑胺补救治疗时为治疗失败。将治疗失败视为治疗终点。分析两组患者治疗的成本效果比(cost-effectiveness ratio，CER)，CER=期望成本/总有效率；计算增量成本效果比(incremental cost-effectiveness ratio，ICER)，ICER=(方案A期望成本-方案B期望成本)/(方案A治愈率-方案B治愈率)。总有效率=总有效人数/治疗总人数×100%。

图1 决策树模型

1.5 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以例数和百分比表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MRSA肺炎患者的菌株耐药情况和耐药基因检测结果 410例继发MRSA肺炎患者均未检出对利奈唑胺、万古霉素、替加环素耐药。410株MRSA全部对青霉素耐药，其中389株(94.88%)对苯唑西林耐药，377株(91.95%)对头孢西丁耐药，46株(11.22%)对利福平耐药，44株(10.73%)对复方磺胺甲噁唑耐药，87株(21.22%)对环丙沙星耐药，264株(64.39%)对四环素耐药，171株(41.71%)对庆大霉素耐药，255株(62.20%)对克林霉素耐药，271株(66.10%)对红霉素耐药。188株(45.85%)同时对2种抗菌药物耐药，132株(32.20%)同时对3种或3种以上抗菌药物耐药。

β-内酰胺类耐药基因mecA、氨基糖苷修饰酶基因aac(6′)/aph(2″)、大环内酯类23SrRNA甲基化酶基因ermA/C、四环素类核糖体保护蛋白基因tetM/K、喹诺酮类耐药基因qnrA/B的检出率分别为100.00%(410/410)、38.29%(157/410)、65.37%(268/410)、57.56%(236/410)、21.00%(86/410)。

2.2 两组临床疗效及病菌清除率的比较 观察组患者临床治疗总有效率为85.85%(176/205)高于对照组的78.05%(160/205)(χ2=4.221，P=0.040)；观察组的病菌总清除率为52.68%(108/205)高于对照组的42.93%(88/205)(χ2=3.910，P=0.048)。见表2、表3。

表2 两组患者的临床疗效的比较(n)

表3 两组的病原菌清除率的比较(n)

2.3 两组患者医院病死率和不良反应发生情况的比较 观察组医院病死率为1.46%(3/205)低于对照组的3.90%(8/205)，但差异无统计学意义(χ2=2.335，P=0.126)；观察组不良反应发生率为4.89%(10/205)低于对照组的14.63%(30/205)，差异有统计学意义(χ2=11.081，P=0.001)。见表4。

表4 两组患者不良反应发生情况的比较(n)

2.4 利奈唑胺与万古霉素治疗MRSA肺炎的成本效果的比较 利奈唑胺治疗MRSA肺炎的CER高于万古霉素。相对于万古霉素，首选利奈唑胺治疗每提高1个单位总有效率需多花费31 321.41元。见表5。

表5 利奈唑胺与万古霉素治疗MRSA肺炎的成本效果的比较

3 讨 论

我国HAP在院内感染性疾病中占比较高，其致病菌中金黄色葡萄球菌占较大比重，近年临床上时常发现多重耐药菌的存在[2]。MRSA耐药现象给肺炎的治疗带来了极大困难，导致患者的病死率增高[8]。MRSA产生多重耐药的原因是多方面的，包括本身耐药基因或引入的外来耐药基因的激活等[9]。因此，了解MRSA的耐药基因，从基因水平研究MRSA对不同抗菌药物的耐药情况，有利于临床合理选择抗菌药物，提高治疗效果，降低HAP死亡率。

相关研究报告显示，利奈唑胺和万古霉素对MRSA肺炎均有较好的疗效[5]。本文基于MRSA耐药基因的特点，对比利奈唑胺与万古霉素治疗医院获得性MRSA肺炎的优势，为临床合理选择药物治疗该病提供参考。本研究结果显示，济南市某三甲医院MRSA的β-内酰胺类耐药基因mecA的检出率为100.00%。mecA 基因是金黄色葡萄球菌通过转座机测获得的变异基因，其转录受mecⅠ、mecR1和mecR2基因的调控，三者相互作用影响mecA基因启动，促进mecA基因表达，增强MRSA的耐药性。MRSA菌株的耐药性大部分是由mecA 基因介导的，因此在MRSA菌株中mecA 基因的检出率极高，这与张利等[7]的研究结果相似。本研究中氨基糖苷修饰酶基因aac(6′)/aph(2″)的检出率为38.29%。MRSA对氨基糖苷类抗菌药物耐药的原因主要是其本身含有编码氨基糖苷类抗菌药物修饰酶的耐药基因，其中aac(6′)/aph(2″)基因最为重要，其通过对抗菌药物分子的氨基或羟基进行修饰，使抗菌药物与核糖体的亲和力下降，从而产生耐药性[10]。大环内酯类抗菌药物耐药与否主要取决于erm基因，erm基因是编码核糖体甲基化酶的基因，可对细菌核糖体50S亚基23S rRNA进行特定核苷酸残基甲基化，其通过改变大环内酯类抗菌药物的结合靶位，降低抗菌药物的亲和力，从而产生耐药性[11]。本研究中，大环内酯类23S rRNA甲基化酶基因ermA/C的检出率为65.37%，四环素类核糖体保护蛋白基因tetM/K的检出率为57.56%，喹诺酮类耐药基因qnrA/B的检出率为21.00%。四环素类抗菌药物的耐药性主要取决于tetM基因，tetM基因编码的因子可通过抑制细菌核糖体相关蛋白的表达而产生耐药性，同时通过tetK基因编码和膜蛋白介导，将药物泵出膜外，降低药物浓度，从而产生耐药[12]，MRSA对氟喹诺酮类药物耐药与具有外排功能的qnrA/B蛋白密切相关，当qnrA/B基因高度表达时，qnrA/B蛋白表达增加，对喹诺酮类药物的主动外排增加，进而产生耐药性[13]。

本研究体外药物敏感检测结果显示，410株 MRSA对青霉素、苯唑西林、头孢西丁、四环素、克林霉素、红霉素、环丙沙星及复方磺胺甲噁唑等药物均有不同程度的耐药，其中多重药物耐药率高达32.20%，这表明MRSA的耐药情况比较严重，但本研究未检出对利奈唑胺、万古霉素耐药的MRSA菌株。多重耐药现象的产生与抗菌药物的交叉使用和滥用密切相关，临床应重视并严格控制抗生素的使用，合理用药。

本文对比了利奈唑胺与万古霉素治疗医院获得性MRSA肺炎的疗效，结果显示，首选利奈唑胺治疗的患者的总有效率为85.85%、病菌清除率为88.78%，均高于首选万古霉素治疗的患者(均P<0.05)。这表明，相比于万古霉素治疗，采用利奈唑胺治疗医院获得性MRSA肺炎疗效更佳。分析其原因可能为，利奈唑胺为新一代恶唑烷酮类抗生素，其可通过结合细菌核糖体上的50 S亚基，切断核糖体和RNA的连接通道，阻止细菌蛋白质的合成，从而发挥清除细菌的作用[14]。一方面，利奈唑胺分子量相对较小，穿透机体肺组织的能力较高，可广泛作用于肺上皮细胞和肺组织中，能够有效地清除肺部细菌；另一方面，由于细菌修饰酶、靶位修饰、主动外排等耐药机制对利奈唑胺的影响较小，利奈唑胺自身不易诱导细菌耐药，也不易与其他抗菌药物产生交叉耐药[15]。这些都使得利奈唑胺治疗医院获得性MRSA肺炎的疗效优于万古霉素。同时，采用利奈唑胺治疗的患者的不良反应发生率低于万古霉素(P<0.05)，具有较好的安全性和用药依从性。

本文采用决策树模型对MRSA肺炎治疗中静脉滴注利奈唑胺和万古霉素的成本效果进行分析，结果显示，利奈唑胺治疗的CER高于万古霉素，虽然相对于万古霉，首选利奈唑胺治疗每提高1个单位总有效率需多花费31 321.41元，但模型所得ICER低于2019年人均国内生产总值(>60 000元)[17]。根据WHO对药物经济学中增量分析结果的推荐[17]，当ICER<人均国内生产总值时，增加的成本完全值得。此外，由于万古霉素治疗导致的不良反应较多，尤其是肝肾功能损害，为防治这些并发症可能会增加更多的费用。因此，利奈唑胺作为治疗MRSA重症肺炎的一线用药，具有较高的性价比。国外学者也报告，相较于万古霉素，采用利奈唑胺治疗医院获得性MRSA重症肺炎的成本低、效果好[16]。这进一步提示临床上可推荐利奈唑胺为治疗MRSA肺炎优先备选方案。

综上所述，ICU医院获得性MRSA肺炎患者的菌株耐药情况严重，耐药基因的检出率高，但未检出对利奈唑胺和万古霉素耐药的MRSA菌株。相比于万古霉素治疗，采用利奈唑胺治疗MRSA肺炎的病菌清除率高、不良反应少、临床疗效和成本效果更优，临床上可推荐首选利奈唑胺治疗MRSA肺炎。