静脉血栓方防治大鼠股骨骨折后深静脉血栓实验研究
2022-08-12段小云曾琳琳吴传红仲瑞雪
段小云,万 军,曾琳琳,沈 灵,吴传红,仲瑞雪
(1.四川省骨科医院药学部,四川 成都 610041;2.西南交通大学生命科学与工程学院,四川 成都 610031)
深静脉血栓(Deep venous thrombosis,DVT)好发于骨科术后,有研究指出,在无预防措施前提下,普通外科术后DVT发生率为10%~40%[1]。股骨血管网丰富且密集,股骨骨折术后需长期卧床,下肢活动明显减少,易并发DVT[2]。对此,有研究发现[3],给予骨科大手术患者预防性抗凝措施,可使DVT发生率及病死率显著降低,对患者术后转归有积极作用。利伐沙班是目前骨科大手术预防DVT的常用药物,改善凝血功能效果显著[4]。中医辨证施治个性化治疗特色,患者接受度较高,一些在长期临床实践经验基础上形成的经验方、保密方和协定方,具有独特的疗效[5]。静脉血栓方为本院用于防治下肢静脉血栓的经验方,临床疗效确切,不良反应少。但静脉血栓方对DVT的防治效果及作用机制需要更深入的研究。基于此,本研究分析静脉血栓方与利伐沙班对大鼠股骨骨折模型的干预效果,为静脉血栓方临床应用提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物:购自成都达硕实验动物有限公司的SPF级大鼠36只,体重220~300 g,雌雄不拘,合格证号:SCXK(川)2020-030,适应性饲养7 d,室温(24±2)℃,湿度60%~65%,自由饮水、进食。本研究经动物实验伦理委员会批准。
1.1.2 药物、试剂及仪器:静脉血栓方由黄芪60 g,党参、丹参各30 g,当归尾15 g,赤芍、桃仁、红花、水蛭、三七、川芎各12 g组成,由四川省骨科医院药学部统一购买并煎制,药材有固定的产地和中药质控。制备方法:药材准确称量,加水浸泡30 min,煎煮2次,每次30 min,过滤后将两次滤液混合,根据《药理与中药药理实验》[6]制定静脉血栓方的剂量,分别煎煮至含生药量为4.48、2.24、1.12 g/ml。阳性药物为利伐沙班片(H20181081,拜耳医药保健有限公司,10 mg/片)。苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色液及戊巴比妥钠购自美国Sigma公司;酶联免疫分析试剂盒购自美国CUSABIO公司,黄嘌呤氧化酶试剂盒及硫代巴比妥酸试剂盒购自北京雅安达生物技术有限公司;普通光学显微镜购自日本OLYMPUS公司,型号为CX-21;全自动凝血分析仪购自日本SYSMEX公司,型号为CS-5100。
1.2 实验方法
1.2.1 分组及造模:将36只大鼠分为空白对照组、模型对照组、阳性药物组及高剂量组、中剂量组、低剂量组(随机数字表简单随机分组法),每组6只。除空白对照组外,其他五组共30只大鼠行机械损伤性造模成股骨骨折模型,称重后,给予1%戊巴比妥钠1 ml/kg腹腔麻醉,使大鼠取仰卧位,消毒、铺巾,双下肢屈髋屈膝固定;在腹股沟外侧纵行切开1 cm,分离皮下组织,显露股骨,使用无菌止血钳夹住股骨两端并向相反方向旋转,当听到啪的声响时,检查股骨干,股骨完整性结构破坏,即确定为造模成功;造模后用1号丝线全层间断缝合切口,另一侧使用相同方法处理,造模后大鼠正常饲养,未使用抗生素。
1.2.2 给药:在造模前7 d与造模后7 d期间对各组大鼠灌胃,阳性药物组给予利伐沙班片11.1 mg/(kg·d)灌胃,空白对照组、模型对照组采用等体积蒸馏水灌胃,高剂量组、中剂量组、低剂量组分别按照静脉血栓方各剂量以1 ml/100 g灌胃,1次/d。
1.3 实验指标
1.3.1 凝血指标:于造模后7 d,取各组大鼠尾静脉血,使用全自动凝血分析仪检测活化部分凝血活酶时间(Activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原时间(Prothrombin time,PT)、凝血酶时间(Thrombin time,TT)及D-二聚体(D-dimer,DD)。
1.3.2 炎症指标:将各组大鼠尾静脉血以3000 r/min离心20 min(离心半径10 cm),取上层清液,采用酶联免疫分析法检测血清肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)水平。
1.3.3 氧化应激指标:采用黄嘌呤氧化酶试剂盒检测血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)水平,采用硫代巴比妥酸法检测血清丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平。
1.3.4 HE染色标本:于造模后7 d,1%戊巴比妥纳1 ml/kg腹腔麻醉后处死,取各组大鼠左大隐静脉组织标本,使用75%、80%、90%、95%、100%乙醇各脱水1 h,石蜡包埋,切成4 μm石蜡切片;石蜡切片再次采用梯度乙醇脱水,行HE染色,脱水封边,送至电镜下观察。
2 结 果
2.1 各组大鼠基本状况 各组大鼠生长良好,除空白对照组外,造模的五组大鼠在造模当日饲料食用量减少,活动量明显减少,但造模后第2天饮食情况逐渐恢复正常,活动量较造模当日增加,但与空白对照组大鼠比较仍较少。
2.2 各组大鼠凝血指标比较 见表1。造模后7 d,造模的五组PT、APTT、TT均较空白对照组显著降低(P<0.05),DD 则较空白对照组显著升高(P<0.05);模型对照组PT低于阳性药物组、中剂量组与高剂量组(P<0.05),APTT、TT低于阳性药物组、低剂量组、中剂量组与高剂量组(P<0.05),DD 则高于阳性药物组、低剂量组、中剂量组与高剂量组(P<0.05);阳性药物组PT、APTT、TT均高于低剂量组、中剂量组(P<0.05),DD则低于低剂量组、中剂量组(P<0.05);各剂量组PT、APTT、TT均随剂量的升高而升高(P<0.05),DD则随剂量的升高而降低(P<0.05)。
表1 各组大鼠PT、APTT、DD、TT比较
2.3 各组大鼠炎症指标比较 见表2。造模后7 d,除阳性药物组外其他造模的四组血清TNF-α、IL-6水平均较空白对照组显著升高(P<0.05);模型对照组血清TNF-α、IL-6水平均高于阳性药物组及低剂量组、中剂量组、高剂量组(P<0.05),阳性药物组则低于低剂量组、中剂量组(P<0.05),各剂量组血清TNF-α、IL-6水平随剂量的升高而降低(P<0.05)。
表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6比较(pg/ml)
2.4 各组大鼠氧化应激指标比较 见表3。造模后7 d,除阳性药物组外其他造模的四组血清SOD水平较空白对照组显著降低(P<0.05),模型对照组低于阳性药物组及低剂量组、中剂量组、高剂量组(P<0.05),阳性药物组血清SOD水平高于低剂量组(P<0.05),低剂量组血清SOD水平低于高剂量组(P<0.05);造模的五组血清MDA水平均较空白对照组升高(P<0.05),模型对照组血清MDA水平高于阳性药物组及低剂量组、中剂量组、高剂量组(P<0.05),阳性药物组则低于低剂量组、中剂量组(P<0.05),各剂量组血清MDA水平随剂量的升高而降低(P<0.05)。
表3 各组大鼠血清SOD、MDA比较
2.5 各组大鼠HE染色标本比较 空白对照组大鼠静脉血管形态结构正常,无炎症细胞浸润;模型对照组见血栓形成,静脉内膜损伤,血管内皮细胞出现剥脱现象,血管壁炎性细胞浸润;阳性药物组及高剂量组未见明显血栓形成改变,但存在少量血管壁炎性细胞浸润;低剂量组及中剂量组可见血栓形成及血管壁炎性细胞浸润,但病理变化小于模型对照组(图1)。
A:空白对照组;B:模型对照组;C:阳性药物组;D:低剂量组;E:中剂量组;F:高剂量组
3 讨 论
DVT在中医学领域属“股肿”“肿胀”“血瘀”等范畴,国家中医药管理局于1994年将DVT正式命名为“股肿”[7]。《素问·痹论篇》中提到,痹在于脉则血凝而不流。《备急千金要方》指出,气血凝滞则为痛,脉道阻塞则为肿。久病气虚,气虚则推动无力,血行受阻,血瘀痹阻于脉,脉络不畅则营血回流受阻,津液外溢而生湿,湿热、瘀血互结阻于脉络,故DVT以湿、热、瘀相互为患,脉络血瘀湿阻为主要病机[8-9]。因此,DVT的中医治疗应使用益气活血、清热化瘀法。静脉血栓方中黄芪益气为君,甘温补气,气血充足,则血行通畅;赤芍清热凉血,散瘀止痛,二者相须为用,能清血分实热、虚热,散瘀血而留滞[10]。红花、桃仁,一温一平,同入心、肝经,有活血祛瘀之功,为活血祛瘀之经典药对[11-12]。当归尾功擅活血,为养血之要药;丹参归心、肝经,长于清心凉血、活血祛瘀、通经止痛,能清肝经之瘀,除心经之烦[13]。《神农本草经》谓水蛭有“主逐恶血、破瘀血”之效,《本草求真》谓三七“气味甘苦,能于血分化其血瘀”,两味合用使瘀血祛、新血生。佐以党参,益气健脾,以防活血祛瘀药之性烈,顾护正气,又取其“气能摄血”之效,防止出血之弊;川芎行气活血,使诸药补而不滞[14]。全方有阴有阳,通中有补,温凉并济,攻补兼顾,动静结合,破而不伐,补而不滞,具有活血祛瘀生新之功效,使营卫恢复周流无阻。
本研究对大鼠行机械损伤性造模,形成股骨骨折模型,在造模前、后共14 d内行灌胃干预,发现模型对照组静脉管腔内血栓形成,且伴静脉内膜损伤、血管内皮细胞剥脱及血管壁炎性细胞浸润,提示股骨骨折术后DVT形成。另外,低剂量组及中剂量组大鼠也可见血栓形成及血管壁炎性细胞浸润,但血栓体积及静脉血管形态损伤小于模型对照组,提示低、中剂量的静脉血栓方对防治DVT有一定疗效。且阳性药物组与高剂量组静脉组织标本图像相近,均存在少量血管壁炎性细胞浸润,但未见管腔内血栓,提示高剂量静脉血栓方对DVT的防治效果与常规西药利伐沙班相当。这也说明,静脉血栓方可发挥其益气活血、清热化瘀、祛瘀生新之功,纠正血瘀湿阻之证,使脉络通畅无阻、营卫气血周流恢复,而减少DVT形成,且高剂量对DVT防治效果最好,可与常规西药媲美。
此外,本研究还就DVT形成机制展开分析,发现模型对照组APTT、TT低于阳性药物组及各高剂量组,DD 则高于阳性药物组及各剂量组,提示股骨骨折术后血液处于高凝状态。而各剂量组PT、APTT、TT均随剂量的升高而升高,DD则随剂量的升高而降低,阳性药物组与高剂量组凝血指标比较差异无统计学意义,提示高剂量静脉血栓方的抗凝效果与利伐沙班相当。现代药理学表明[15],黄芪可降低血小板黏附率,改善血液流变学,川芎抑制血小板聚集,目前在抗血栓治疗中常用。这也可能是静脉血栓方抗凝效果显著的原因。炎症及氧化应激也参与DVT形成,全身炎症反应可激活凝血系统,引起血栓形成;氧化应激的显著增强也能损伤血管内皮细胞,促进血小板黏附,加速血栓形成[16-17]。本研究中,模型对照组血清TNF-α、IL-6及MDA水平高于阳性药物组及各剂量组,各剂量组随剂量的升高而降低;模型对照组血清SOD水平低于阳性药物组及各剂量组,低剂量组则低于高剂量组;且高剂量组与阳性药物组上述指标比较均无统计学差异。提示静脉血栓方还具有抗炎、抗氧化应激作用,且高剂量静脉血栓方的抗炎、抗氧化应激效果与利伐沙班相近[18]。考虑与红花、三七、赤芍等中药材具有抗炎、抗氧化作用,对抑制炎症、减轻氧化应激具有良好功效有关[19-20]。
综上所述,静脉血栓方对防治股骨骨折术后DVT疗效良好,可通过抗凝、抗炎、抗氧化应激等作用减少血栓形成,且高剂量静脉血栓方疗效肯定,能进一步降低患者血栓风险。