益血生髓颗粒对苯试剂诱导的再生障碍性贫血小鼠造血功能及T细胞亚群的影响

杨 桐，田春洪，田 原，乔金丽，杨小洁

(云南省中医中药研究院，云南 昆明 650032)

再生障碍性贫血(Aplastic anermia，AA)是由于化学、物理及各种不明原因引起的骨髓造血功能衰竭，临床上以较严重的贫血、出血和全血细胞减少为主要表现的综合征[1-2]。现代医学研究发现AA发病机制与辅助/诱导CD3+CD4+T细胞和细胞毒性CD3+CD8+T细胞(CTL)比例倒置、CD4+T细胞分化的Th1和Th2细胞平衡失调，以及骨髓抑制状态和造血细胞的凋亡有关[3-5]。云南省中医中药研究院研究员，国医大师张震根据临床经验自拟益血生髓方治疗非重型AA取得了良好的疗效，但研究仅限于少量临床观察[6]。为使本方在临床研究和应用中提供基础，本研究以苯试剂化学诱导方法建立AA小鼠模型，通过观察血细胞、T细胞亚群和骨髓病理学等变化情况探讨益血生髓颗粒对AA小鼠造血及免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 近交系BALB/c小鼠，全雄，SPF级，体重17～22 g，斯贝福生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK(京)2019-0019。室温18～20 ℃，饮用消毒灭菌水，食用Co60灭菌饲料。实验经云南省中医中药研究院动物实验伦理委员会批准，编号：20210021。

1.2 药物和试剂 益血生髓方颗粒(药物组成：黄芪、补骨脂、菟丝子、淫羊藿、柴胡、鹿角胶、香附、郁金、枳实、白芍)由北京康仁堂制剂中心提供，批号210409；配方颗粒规格：12 g/袋。司坦唑醇片,批号20120036。苯试剂，分析纯(AR≥99.5%)，货号B803131。玉米油，药用级，货号8001-30-7。FITC-anti-mouse CD3、APC-anti-mouse CD4、FITC-anti-mouse IL-4、PE-anti-mouse CD8a和FITC-anti-mouse INF-γ为美国eBioscience公司生产。小鼠IL-2 ELISA试剂盒，武汉博士德生物公司生产。小鼠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)ELISA试剂盒，英国Abcam公司产品。

1.3 实验仪器 流式细胞仪，美国BD LSRⅡ型。医用净化工作台，CJ-2F型，冯氏实验动物设备有限公司产品。82-1型电动离心机，上海医用仪器厂。LD-96A酶标仪，美国Thermo Fisher公司产品。Kx-21血象分析仪，日本Sysmex产品。RM2135石蜡切片机，德国Leica公司产品。

1.4 动物分组、造模和给药 采用随机数字表法将72只SPF级BALB/c雄性小鼠分为正常对照组、AA模型组、司坦唑醇阳性对照组(阳性对照组)、益血生髓颗粒低剂量组(低剂量组)和益血生髓颗粒高剂量组(高剂量组)，正常对照组12只，其余各组15只，分笼饲养，适应性喂养1周后开始实验。除正常对照组外，其余各组按文献[7]方法造模。方法：AA模型组，低、高剂量组和阳性对照组小鼠，予苯试剂+玉米油(1∶1配制)，2 ml/kg (1 ml苯+1 ml玉米油均匀混合)，背部皮下注射，每周4次，持续7周，共注射28次。正常对照组小鼠予玉米油2 ml/kg，背部皮下注射，每周4次，持续7周，共注射28次。低、高剂量组小鼠予以益血生髓颗粒溶液灌胃15 d，按实验动物和人的体表面积比值表折算小鼠等效灌胃剂量[8]，将12 g配方颗粒均匀溶于120 ml蒸馏水，过滤浓缩至120 mg/ml备用，低剂量组小鼠用药1.2 g/(kg·d)，高剂量组小鼠用药4.8 g/(kg·d)。阳性对照组灌胃司坦唑醇混悬液2 mg/(kg·d)，持续15 d。正常对照组和AA模型组小鼠予等量0.9%氯化钠溶液灌胃15 d，各组给药体积均为0.2 ml/10 g。

1.5 检测指标

1.5.1 外周血血细胞骨髓有核细胞数(BMNC)：每组各取10只小鼠颌下静脉采血约0.2 ml，置15%EDTA-K2抗凝的EP管中混匀，血常规分析仪测白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)。取血结束后CO2窒息法安乐死小鼠，手术取右侧股骨，制备骨髓细胞混悬液，取20 μl细胞混悬液加入红细胞裂解液后在显微镜下计算BMNC的数量。

1.5.2 T淋巴细胞亚群：每组各取8只小鼠颌下静脉采血放入1.5 ml EP管中，1000 r/min，离心10 min，将血浆吸入流式管中，每个流式管中加入2 ml RBC裂解液，1000 r/min离心5 min，每管加入含1% FBS 2 ml，1000 r/min离心5 min，计算体积后每管加20 μl的CD4-APC(0.2 μg/μl)，CD8a-PE(0.2 μg/μl)和CD3-FITC(0.5 μg/μl)抗体，避光孵育20 min，加2 ml 1% FBS，1000 r/min离心5 min，加入300 μl的1% FBS液，流式细胞仪检测外周血T细胞亚群在淋巴细胞中的百分数。小鼠外周血取样结束后，CO2处死，超净工作台下无菌取脾，钝头剪刀除去白色结缔组织，放入装有PBS的培养皿中。弯头手术剪将脾切成约3 mm数个小块，将脾脏组织置于铁质滤网，均匀研磨经200目筛网过滤，用PBS将滤网上粘连的脾脏细胞冲洗2次，将细胞悬液1000 r/min离心10 min制成脾细胞悬液，1 ml悬液加入10 μl抗体检测，FITC-anti-mouse INF-γ标记Th1细胞，FITC-anti-mouse IL-4标记Th2细胞，室温避光孵育30 min，1500 r/min离心8 min后加入0.4 ml PBS流式细胞仪检测脾脏Th1和Th2细胞百分数[9]。

1.5.3 ELISA检测IL-2、G-CSF和M-CSF：每组各取10只或8只小鼠颌下静脉采集外周血，室温放置20 min后，2500 r/min离心5 min，取血清放置-80 ℃冰箱保存。检测前提前30 min将样品从冰箱取出恢复室温，按小鼠IL-2、小鼠G-CSF和小鼠M-CSF ELISA检测试剂盒上的步骤说明操作，用酶标仪在终止反应5 min内读取450 nm的吸光度(OD)值，保存数据通过绘制标准曲线在坐标上找出对应的浓度，计算血清IL-2、G-CSF和M-CSF水平。

1.5.4 HE染色骨髓病理学： 取小鼠左侧股骨，10%福尔马林固定24 h，再用Von Ebeners液(饱和氯化钠水溶液50 ml，蒸馏水50 ml，浓盐酸8 ml)骨组织脱钙2 d，包埋、切片后将切片浸入二甲苯Ⅰ溶液中10 min，后放入二甲苯Ⅱ溶液浸入10 min，依次将切片放入梯度乙醇中各5 min，流动水冲洗切片约3 min；然后苏木素染色5 min，流动水冲洗将组织从甘紫色变为蓝色，使用盐酸乙醇分化数秒后伊红染色4 min。染色处理完成后将切片依次放入上行梯度乙醇中，分次约5 min脱水。后将切片分别浸入二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ中各5 min透明处理，使用树脂封片，HE染色后在显微镜下进行骨髓病理学分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS 22.0、Graph Pad Prism 8.0.1统计学软件进行分析。计量资料用均数±标准差表示，两组数据若正态分布使用LSD-t检验，一组呈偏态分布用Mann-Whitney U检验；多组数据间若正态分布且方差齐用单因素方差分析(ANOVA)，不满足则采用Kruskal-Wallis H检验；P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般情况 与正常对照组小鼠对比，AA模型组小鼠出现体重和食欲减轻，神疲少动，毛发枯黄，爪甲苍白，偶发便血等表现，且随苯试剂给药次数增加而愈发明显。实验结束前，正常对照组小鼠死亡1只，AA模型组死亡小鼠2只，其余各组死亡小鼠共4只。

2.2 各组小鼠外周血血细胞数量比较 AA模型组小鼠外周血血细胞WBC、RBC、HGB、PLT均低于正常对照组(P<0.05)，说明苯试剂诱导的造模方法导致小鼠造血功能受损，骨髓抑制并造成血细胞计数显著降低。经益血生髓颗粒和司坦唑醇治疗后，低、高剂量组和阳性对照组血细胞WBC、RBC、HGB、PLT均高于模型组(P<0.05),高剂量组对RBC和PLT的提升作用高于阳性对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠外周血WBC、RBC、HGB、PLT细胞数量比较

2.3 各组小鼠血清IL-2及股骨BMNC数量比较 见表2。 AA模型组血清IL-2浓度高于正常对照组(P<0.05)，低、高剂量组和阳性对照组血清IL-2浓度低于AA模型组(P<0.05)，低、高剂量组和阳性对照组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。AA模型组小鼠BMNC数量显著低于正常对照组(P<0.05)，低、高剂量组和阳性对照组小鼠BMNC数量均显著高于AA模型组(P<0.05)，高剂量组BMNC数量高于低剂量组(P<0.05)，低剂量组和阳性对照组小鼠的BMNC数量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组小鼠血清IL-2和股骨BMNC数量比较

2.4 各组小鼠血清G-CSF和M-CSF水平比较 见表3。各组小鼠血清G-CSF和M-CSF浓度均显著低于正常对照组(P<0.05)，高剂量组G-CSF浓度大于低剂量组(P<0.05)，而M-CSF的浓度差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组小鼠血清G-CSF和M-CSF水平比较(pg/ml)

2.5 各组小鼠外周血和脾脏T淋巴细胞亚群比较 见表4、5。与正常对照组比较，AA模型组小鼠外周血CD3+CD4+T显著降低，CD3+CD8+T显著升高，CD4+/CD8+比值显著降低(P<0.05)，与AA模型组比较，低、高剂量组和阳性对照组CD3+CD4+T升高，CD3+CD8+T降低，CD4+/CD8+比值升高(P<0.05)。高剂量组CD3+CD4+T与低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)，CD3+CD8+T低于低剂量组(P<0.05)，CD4+/CD8+比值高于低剂量组(P<0.05)。AA模型组小鼠脾脏Th1细胞和Th2细胞与正常对照组比较差异显著(P<0.05)；阳性对照组Th1细胞百分率高于AA模型组(P<0.05)，低、高剂量组和阳性对照组Th2细胞百分数低于AA模型组(或P<0.05)。

表4 各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群比较

2.6 各组小鼠股骨骨髓病理学情况 正常对照组小鼠股骨骨髓造血组织结构完整，骨髓增生活跃，骨髓有核细胞正常，造血细胞在髓腔中分布均匀且数量丰富。AA模型组小鼠骨髓增生程度减低，造血组织面积明显减少，非造血组织增多，可见脂肪组织填充，骨髓有核细胞减少，髓腔内血窦扩张。低剂量组、高剂量组和阳性对照组骨髓增生程度较AA模型组出现不同程度恢复，脂肪细胞减少，较正常对照组骨髓有核细胞减少。高剂量组骨髓增生程度较低剂量组和阳性对照组高(图1)。

表5 各组小鼠脾脏Th1、Th2细胞比较(%)

A：正常对照组；B：AA模型组；C：低剂量组；D：高剂量组；E：阳性对照组

3 讨 论

血之生成与五脏功能有关，最重要的是先天之本肾与后天之本脾，髓为肾所生，受肾气的充养，古籍对其生血与造血关系提及较少，在《张氏医通·诸血门》提到气与血两者“总由水谷所化，其始也浑然一体未分清浊，得脾气之鼓云，如雾上蒸于肺而为气；气不耗归精于肾而为精，精不泄归精于肝而为清血”，并归结说血之化成“实不离五行之气化”。由于血与气是人体阴与阳的代表，气血相生且密切相关，只有气机保持调畅，才能拥有充沛的血液濡养周身。国医大师张震认为再生障碍性贫血的治疗法则应遵循“谨守病机、各司其属”的原则，调护患者先后天之本，遵循“一体两翼”治疗方法，即以肝为主体，脾肾为两翼，促进肝之疏泄条达，气机调畅功能，并顾护脾肾先后天之本。张老自拟的益血生髓汤(又名疏调生血汤)，以调畅气机为核心，兼以调护脾肾，起到养血生血、疏肝补肾、健脾强髓的作用。临床实践中还应根据患者实际病情，发挥中医辨证论治优势，针对其继发证候或兼夹证候，采用相应治法。

AA动物模型方法包括物理、化学和免疫介导等，目前免疫介导的AA模型应用较多，方法为取DBA/2小鼠胸腺淋巴结细胞悬液输注经6.0 Gy60Coγ射线全身均匀照射的BALB/c小鼠尾静脉中[10]，该方法造模成功率高，但有文献[11]报道动物死亡率高，原因可能与放射剂量实践中难以控制和造模后动物骨髓重度衰竭有关。对于需要较长时间给药治疗的研究，应用免疫诱导方法AA造模，造模后小鼠的生存期可能无法维持到药物给药结束。化学诱导的AA模型常用环磷酰胺、白消安、氯霉素、苯试剂等，单纯用苯试剂诱导的AA模型，方法简单，成本较低，苯通过其毒性代谢产物导致骨髓造血微环境和造血功能的抑制，造模后动物生存时间较免疫诱导方法较长，AA模型与临床慢性AA表现有相似点，能够满足需要一定时间的中药药效实验要求。缺点为造模周期长，研究显示苯试剂介入至少25次(2 mg/kg)AA模型小鼠各种血细胞数量才能明显减少[12]。Faiola等[13]研究发现雄性小鼠对苯试剂敏感性高于雌性小鼠，故本研究动物全部选用了雄性小鼠，通过对AA组小鼠血细胞、BMNC、G-CSF、M-CSF等与正常对照组的比较，苯试剂诱导的AA模型方法是稳定有效的。

T细胞又称T淋巴细胞，T细胞可进一步分为辅助/诱导T细胞(CD3+CD4+T)、抑制/细胞毒性T细胞(CD3+CD8+T)、功能亚群(CD25+)和凋亡亚群(CD95+)等， CD4+T细胞根据分泌因子不同可分为Th1和Th2两个亚群[14-16]。研究发现AA的发病机制与T淋巴细胞介导的造血功能抑制联系紧密[17]，表现为CD3+CD4+T细胞降低，CD3+CD8+T细胞升高，CD4+/CD8+比值倒置和Th1/Th2细胞比例失衡造成的免疫紊乱是关键因素[18-19]，INF-γ诱导的Th1细胞可释放IL-2、INF-γ等细胞因子，Th2细胞分泌IL-4、IL-5等细胞因子，CD8+CTL细胞释放穿孔素、颗粒酶对造血干细胞持续破坏，导致骨髓造血功能重度抑制并使血细胞减少[20-21]。集落刺激因子G-CSF和M-CSF是血细胞增殖分化中必需的刺激因子，可促进造血干细胞分化和增殖，刺激巨噬细胞、粒细胞成熟，增加外周血细胞的数量。实验研究结果显示益血生髓颗粒对AA小鼠具有一定免疫调节作用，表现为低、高剂量组与AA模型组比较，外周血CD3+CD8+T细胞降低和CD3+CD4+T细胞升高，CD4+/CD8+比值升高；高剂量组效果优于低剂量组，可降低脾脏Th1细胞百分数和血清IL-2水平，而阳性对照组也具有相同作用。阳性对照组Th2细胞百分数高于AA模型组，低、高剂量组对Th2细胞的影响则不明显。低、高剂量组可提高AA模型小鼠外周血血细胞WBC、RBC、HGB、PLT和骨髓BMNC数量，高剂量组可提高集落刺激因子G-CSF和M-CSF浓度。股骨骨髓病理学显示益血生髓治疗组的骨髓细胞数、骨髓造血环境较AA模型组有改善，说明益血生髓颗粒可能通过调节集落刺激因子水平，促进造血组织增生和造血干细胞增殖，刺激血细胞成熟并增加外周血血细胞和骨髓有核细胞数量，起到一定程度造血恢复作用，其详细机制具有进一步研究价值。综上所述，益血生髓颗粒对AA小鼠具有一定免疫调节作用和骨髓造血功能抑制改善作用。