乌骨鸡胚胎期脂肪组织可视化标本的制作方法

2022-08-12余自强龚梦梦李秋玉陈粉粉

畜禽业 2022年8期

余自强，龚梦梦，李秋玉，陈粉粉

(西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224)

0 引言

动物标本是动物学相关专业教学、科研和科普工作的重要载体[1-5]。目前，按照工艺处理和技术手段将动物标本分为浸制标本、剥制标本、骨骼标本、干制标本和仿真标本等[6]。而在这些标本制作过程中，有害物质不可避免的存在，低毒环保材料的使用是动物标本制作的发展趋势[7-8]，水晶滴胶作为新型环保材料，也被应用于标本的制作中[5，9]。

已有的研究表明，脂肪在鸡胚胎期以皮下脂肪组织的沉积为主，虽然鸡胚胎期脂肪组织生长发育的特征已有报道，但对于具有“乌皮、乌骨、乌肉”特征的乌骨鸡胚胎期脂肪组织色泽和沉积部位的变化特点鲜有报道[10-11]。Chen等[10]应用甲醛固定和KOH处理获得白羽肉鸡胚胎期脂肪组织的可视化标本，可以直观观察胚胎期脂肪组织沉积特点，但有关鸡胚胎期脂肪组织可视化标本制作及可持久保存标本的制作方法还鲜有报道。目前，鸡胚胎期脂肪组织可视化标本可使得脂肪组织整体成像成为可能[9]，而滴胶标本应用于动物标本制作也使得标本的保存方法得到改进[6，8，13]。本研究通过对标本固定剂的选择、KOH的浸泡时间和标本保存方式等条件的摸索，提出能用于教学和研究的乌骨鸡胚胎期脂肪组织可视化标本的制作方法。通过乌骨鸡胚胎期脂肪组织标本制作，可以观测乌骨鸡胚胎期脂肪组织沉积的全过程，为乌骨鸡胚胎期脂肪组织发育的相关研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 胚胎采集

实验用种蛋为无量山乌骨鸡种蛋，购自云南大理南涧无量山乌骨鸡种禽场。种蛋称重后依据取样时间以组间蛋重无差异随机分组后入孵。孵化条件参照李秋玉等[11]报道进行。

将孵化24 h记为孵化第1日胚龄(E1)，在E11、E12、E14、E16、E18、E20和出壳当日(D0)取发育正常的鸡胚用于脂肪组织可视化标本制作。

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂：多聚甲醛、氢氧化钾、氯化钠、磷酸二氢钾、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠、丙三醇等均为分析纯，购自广东光华科技股份有限公司；环氧树胶-水晶滴胶(A胶和B胶)购自聚恒创电子材料有限公司；凡士林购自致远化学试剂有限公司。

主要仪器：电脑全自动孵化出雏机(FT-KFC4，北京春明方通电子有限公司)、单反相机(SONY-a7r3)。

1.3 方法

1.3.1 样本固定

鸡胚用新配PBS清洗3次去除其他附着物，有羽毛样本用镊子轻轻拔掉羽毛。将清除干净的鸡胚固定在10%甲醛或者10%多聚甲醛溶液玻璃瓶中固定24 h。

1.3.2 KOH处理

鸡胚胎期皮下脂肪紧贴于皮肤之下，为保证脂肪组织完整性，参照Chen 等[10]报道方法，用1% KOH溶液浸泡固定样本后进行去除皮肤暴露脂肪组织的处理。

1.3.3 去皮及观察标本制备

从1% KOH浸泡液中取出鸡胚，使用新鲜配制PBS缓冲液冲洗2次，转移至干净培养皿中使用眼科镊进行去皮处理。按照腹部—背部—腿部—头部—两翅—四肢的顺序去除皮肤，用PBS缓冲液清洗去皮后的鸡胚，使用滤纸吸除鸡胚上残余PBS并及时放入盛有100%甘油的培养皿中观察和拍照。

1.3.4 滴胶标本制备

按照准备—打底—固定—封样—封顶—打磨抛光等6个步骤进行[12-13]。①清洗烘干模具备用，制备标本前在模具内部涂抹一薄层凡士林便于脱模。②将环氧树胶-水晶滴胶混合液(A胶：B胶=2.5:1)倒入模具中高2～3 mm用来打底，室温(10℃～20℃)通风处风干24 h。③将处理好的鸡胚放入模具中并摆好姿势，倒入适量(能使鸡胚固定)现配的环氧树胶-水晶滴胶混合液，室温(10℃～20℃)通风处风干24 h。④向模具中加入现配的环氧树胶-水晶滴胶混合液直到淹没鸡胚全身各处，室温(10℃～20℃)通风处风干24 h。⑤再次倒入现配的环氧树胶-水晶滴胶混合液高出标本2～3 mm封顶，室温(10℃～20℃)通风处风干24 h。⑥取出固化好的标本进行打磨抛光即完成树胶标本制备。

2 结果与分析

2.1 多聚甲醛可替代甲醛做固定剂

鉴于甲醛具有挥发性强及对操作者健康的影响，尝试使用10%多聚甲醛溶液替代10%甲醛溶液做固定液[14-16]。根据预实验观察结果，E14胚龄脂肪组织已经可以清晰看到分布部位及脂肪组织可以分离，所以选用E14胚龄胚胎比较不同固定液对胚胎的固定效果。如图1所示，10%多聚甲醛溶液(图1A)和10%甲醛溶液(图1B)对去皮的难易程度和制作标本的质量无明显差别，仅从脂肪组织颜色上看，10%多聚甲醛溶液(图1A)做固定液处理的标本更接近于组织本身固有色泽。所以，后续实验均采用10%多聚甲醛溶液作为固定液。

A 10%多聚甲醛溶液固定标本 B 10%甲醛溶液固定标本

2.2 KOH处理时间随胚龄增加而加长

在标本制作中，皮肤剥离是最关键的步骤。1% KOH处理的时间过短，皮肤未和组织发生解离则皮肤很难剥离干净；处理的时间过长，则部分皮肤溃烂，影响脂肪组织完整性，也很难全部剥离皮肤。经过多次实验摸索，发现随着胚龄增加，羽毛逐渐长出，皮肤需要用1% KOH处理的时间逐渐增加。如表1所示，在E11-E14胚龄使用1% KOH处理24 h即可实现轻松剥皮；E16胚龄的处理时间需要延长至36 h；E18胚龄开始则需要处理48 h。

表1 不同胚龄1% KOH浸泡的参考时间

2.3 脂肪组织可视化的呈现

将剥皮处理后的标本用PBS缓冲液清洗干净，置于甘油中保存，可观察脂肪组织的沉积部位情况，并可进行拍照，清楚记录脂肪沉积情况。由图2可以看出，在E11已有少量脂肪组织沉积于颈部和腿部，但无法分离完整的脂肪组织；E12腿部的脂肪组织可以分离，且随着胚龄的增加，脂肪的沉积量也在增加(E14-D0)，脂肪组织从最初的颈部和腿部到胸部和腹部均有分布，且主要集中在颈部和腿部。脂肪组织颜色不同于成年无量山乌骨鸡脂肪组织呈褐色或者黑色，在胚胎期还无黑色素沉积于脂肪组织中，脂肪组织呈白色。

图2 不同孵化胚龄脂肪组织的沉积变化

2.4 滴胶标本可永久保存

含脂肪标本在甘油中只能短期存储，其余传统保存方法多用液体试剂。而滴胶标本作为新型标本保存方法之一，兼具了保存性和艺术性，本实验中尝试引入用滴胶固化保存胚胎期标本，并发现该方法可进行胚胎期脂肪组织可视化标本的永久保存(见图3)。从滴胶标本制作的结果来看，因胚胎标本在胶中形态不容易固定，很难统一成相同姿态；脂肪组织颜色发生轻微变化且组织量增加颜色变化明显(见图3，E16～E20)；并且因为制作过程中进胶问题，有可能胶中气泡过多从而使标本清晰度受到影响(见图3，E20)。

图3 不同孵化胚龄滴胶标本

3 讨论

动物标本制作的固定剂选择方面，多聚甲醛可替代甲醛作为固定液[14-15]。Chen 等[10]在制作白羽肉鸡胚胎期脂肪组织的可视化标本时应用甲醛做固定，但由于甲醛固定液具有极强的刺激性和腐蚀性，人吸入散发的甲醛气体会有中毒、过敏、哮喘、肺功能损害等危害[8，16]，而多聚甲醛是一种甲醛脱水缩聚而成的固态甲醛，与甲醛水溶液相比，多聚甲醛属于温和型固定剂，其挥发性气味小，固定后的细胞或组织收缩性较小，背景清晰度较高[14-15]。实验结果表明，使用10%多聚甲醛溶液固定鸡胚胎效果良好。

环氧树胶-水晶滴胶是目前滴胶标本制作的常用试剂，其主要成分包含高纯度环氧树脂和固化剂，以及部分其他物质共同组成，用作标本固化使得标本耐腐蚀、晶莹剔透，很好地保护标本的同时还能增加标本的艺术效果[17-18]。由于费用较高，滴胶标本初期常见于植物和昆虫工艺品制作使用[13，18]。近年来，在昆虫学、植物学及中药学等实验教学标本制作中也得到广泛使用，但在动物标本制作中报道较少[5，9，13，18]。本次实验选用的鸡胚个体较大，所以滴胶固定标本的固化时间较昆虫和植物标本相比用时较长[5，18]。除进行科学研究外，鸡胚胎期脂肪组织制成滴胶固化标本，可以立体呈现标本特征、无毒无害、便于保存和用于教学。