幽门螺杆菌阳性胃癌中vacA基因型的分布及其与MEX3A表达的关系

勾佳钰，张忠，薄威，梁莉，李佳琦，李晓波，王旭光

（沈阳医学院病理学教研室，沈阳 110034）

胃癌是常见的恶性肿瘤，我国胃癌发病率约占全世界的50%，晚期胃癌的死亡率极高，因此，疾病的早期发现、早期治疗尤为重要［1］。大量研究表明，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）与胃癌等消化道疾病密切相关。临床上约 70%的胃癌患者有H.pylori感染，H.pylori被世界卫生组织列为胃癌Ⅰ类致癌因子［2］。H.pylori阳性人群发生慢性浅表性胃炎、肠化生、异型增生及胃癌的比例高于H.pylori阴性人群［3］。但并非所有慢性浅表性胃炎患者最终都会发展成胃癌，这与H.pylori菌株特性、患者的易感性以及环境等因素有关［4］。

虽然H.pylori菌株均含有细胞空泡毒素基因A（valculating toxin gene A，vacA），但并非所有vacA基因都具有表达活力，这与该基因序列信号区及中间区组成情况的多态性密切相关。vacA基因存在变异位点信号区s（s1、s2），负责编码信号肽的一部分及成熟蛋白的N末端，以及中间区m（m1、m2），负责编码部分的P58结构域［5-6］。这些基因变异位点的不同结合方式（s1m1、s1m2、s2m1、s2m2型）等可使H.pylori的毒力及致病性发生变化，vacAs1m1和vacAs1m2基因型的毒力更强［7］。本课题组前期研究［8］发现，vacA优势基因m1、s1及s1m1亚型与尾型同源框转录因子2（caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2）表达呈负相关，存在以上3种优势基因时，CDX2阳性表达率明显降低。CDX2是肠上皮特异性转录因子，主要位于染色体13q12～13，参与维持肠上皮早期分化，是肠上皮分化的早期标志物。研究［4］表明，胃癌组织中CDX2与Reg ⅣmRNA和蛋白的表达呈正相关，是一种胃肠道的保护因子，在胃癌细胞系AGS及MKN-45中过表达CDX2可抑制癌症细胞迁移和增殖。

研究表明，秀丽隐杆线虫肌肉增生蛋白3A（muscle excess 3A，MEX3A）可 与CDX2mRNA 在3’非翻译区特定结合，从而抑制胃癌和结直肠细胞癌细胞系中CDX2的表达水平；同时，MEX3A过表达还可影响细胞极性，沉默MEX3A可抑制胃癌细胞在G1/M期分裂，并使其集落形成能力下降；MEX3A还参与细胞更新分化、内稳态调节、有多元分化能力，在维持肠道干性中有重要作用［9-11］。因此，研究H.pylori阳性患者术后vacA不同基因亚型与MEX3A表达是否存在相关性，及vacA具体亚型与MEX3A在胃癌发生发展不同阶段表达的相关性，不仅有助于探讨疾病机制，还可为早期诊断提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2010年1月至2014年12月沈阳医学院附属中心医院外科手术切除的H.pylori阳性胃癌石蜡包埋组织样本98例，其中，男76例，女22例，年龄36～87岁。病理诊断均采用双盲法。本研究获得沈阳医学院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 PCR检测H.pylori基因表达：每个石蜡包埋标本连续切片10～12 片（厚度4 μm）。按照GT pureTMFFPE试剂盒说明书提取总DNA。利用H.pylori尿素酶基因对H.pylori基因进行PCR检测。选用H.pylori vacAs1、m1和m2 特异引物（表1），通过巢式PCR分别对vacAs1、m1和m2 进行扩增。

表1 H.pylori vacA s1、vacA m1、vacA m2基因引物序列Tab.1 Primer sequence of H.pylori vacA s1，vacA m1，vacA m2

1.2.2 免疫组化染色法检测MEX3A蛋白表达：采用ElivisionTMplus法检测MEX3A蛋白的表达。将鼠抗人MEX3A多抗（美国Abcam公司，1 ∶400稀释）滴加于切片，4 ℃孵育过夜。按照Elivision Plus检测试剂盒（KIT-9901）、即用DAB显色试剂盒（均购于福州迈新生物技术公司）说明书，以 PBS 代替一抗作为阴性对照，以阳性表达的胃癌组织作为阳性对照。

免疫组化评分标准：光学显微镜下观察MEX3A免疫组化染色情况，可见其在细胞核、细胞质内阳性表达。根据染色程度评分，无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；根据染色细胞数评分，阳性细胞数＜10%为0分，10%～30%为1分，＞30%～50%为2分，＞50%为3分；将染色程度与阳性细胞数评分相加，0分为（-），1～2分为（+），3～4分为（++），5～6分为（+++），（+）～（+++）为阳性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0 软件进行统计分析。采用χ2检验与logistics回归分析H.pylori阳性胃癌中MEX3A及vacA的表达情况及相关性。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MEX3A表达与临床病理特征的关系

本组病例年龄呈偏态分布，中位年龄60岁，＞60岁60例，≤60岁38例；肿瘤病理分期参照AJCC第八版标准［12］，肿瘤直径＜5 cm 48例，≥5 cm 50例；中低分化胃癌82例（83.67%），高分化胃癌16例（16.33%）；有淋巴结转移72例（73.47%）；按照 Lauren 分型，肠型胃癌59例（60.20%），弥漫型胃癌39例（39.80%）。所有胃癌组织中均有MEX3A表达，且经年龄、性别调整后，MEX3A表达与胃癌肿瘤分化程度相关，中低分化胃癌组织中MEX3A的表达阳性率高于高分化组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。经年龄、性别调整后，MEX3A的表达与肿瘤直径、TNM分期、浸润深度、Lauren分型及淋巴结转移均不相关（P＞ 0.05）。表明MEX3A有望成为胃癌的标志物，并在中低分化胃癌的疾病进展中发挥作用 。

表2 MEX3A表达与胃癌患者病理特征Tab.2 Relationship between MEX3A expression and clinicopathological characteristics of patients with gastric cancer

2.2 不同H.pylori vacA基因亚型在胃癌中的分布

PCR结果显示，本组98例胃癌组织标本中，vacAs1亚型（65/98，66.30%）表达水平显著高于其他s亚型，vacAm1亚型（37/98，37.80%）表达水平显著高于其他m亚型，vacAs1m1亚型（29/98，29.60%）表达水平显著高于其他联合亚型，差异均有统计学意义（均P＜ 0.05）。见表3。

表3 不同H.pylori vacA基因亚型在胃癌中的分布［n（%）］Tab.3 Distribution of different H.pylori vacA gene subtypes in gastric cancer ［n （%）］

2.3 胃癌组织中H.pylori vacA优势基因型与MEX3A表达的关系

结果显示，本组标本中vacAs1、vacAm1及vacAs1m1这3种亚型的表达水平高于其他亚型，对这3种高表达的vacA优势基因型与MEX3A表达之间的关系行进一步分析，发现MEX3A的表达与vacAs1亚型密切相关，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表4。

表4 H.pylori vacA优势基因型与MEX3A表达间的关系［n（%）］Tab.4 The relationship between the dominant genotypes of H.pylori vacA and the expression of MEX3A ［n（%）］

3 讨论

胃癌具有早期发现及诊断困难的特点，且发病后死亡率较高，其发病机制尚未明确，可能涉及多种分子生物学通路［13］。H.pylori感染与胃癌的发生、发展密切相关，而几乎所有的的H.pylori都含有vacA基因，但不同种H.pylori的致病能力不同，推测与vacA基因的不同亚型密切相关。研究［14］显示，仅60%有vacA基因表达的H.pylori具有毒力。其中，vacA基因s亚型与黏膜的炎性浸润有关，s1m1亚型毒力最强，而s2m2亚型则无毒，目前尚未发现s2m1亚型菌株，而m亚型与胃黏损伤密切相关［15］。

本课题组前期研究［8］显示，vacA优势基因型与CDX2蛋白表达呈负相关。CDX2是一种肠上皮分子标志物，vacA优势基因m1、s1及s1m1亚型的表达可抑制CDX2表达，且与Ⅲ型胃黏膜肠上皮化生关系密切。胃黏膜的肠上皮化生通常被认为是一种重要的癌前病变，对胃癌的发生、发展有重要意义。研究［11］表明，通过对胃癌细胞株AGS及结肠癌细胞系Caco-2全基因组筛选，发现RNA结合蛋白MEX3A与尾CDX2mRNA 在3’非翻译区存在特定的结合决定簇，从而抑制胃癌和结直肠细胞癌细胞系中CDX2的表达水平，同时MEX3A的过表达也可对细胞极性产生影响。

MEX3A是首次发现于秀丽隐杆线虫的RNA结合蛋白MEX-3家族成员之一，其N端有2个串联的重复异质核糖蛋白K同源结构（其中KH域可与微RNA结合），C端有1个环指结构域［16］，具有高度保守的特征，该结构域约80%的氨基酸序列相同，可能通过介导特定因子，如RIG形成泛素化的作用，参与促进肿瘤细胞增殖、转移。因此，推测MEX3A可能参与胃癌发生、发展中转录后调控的相关信号通路，但目前尚未见关于MEX3A在胃癌组织中表达情况的研究。本课题组前期研究发现MEX3A表达与不同vacA基因亚型的表达相关，为了深入了解H.pylori对胃黏膜的毒理作用及致癌机制，本研究对98例H.pylori阳性胃癌组织进行研究后发现，vacAs1、m1和s1m1的表达水平高于其他亚型，提示在辽宁地区这3个vacA基因亚型是与胃癌发展相关的优势基因亚型，与本课题组前期研究结果一致。本研究还发现，MEX3A的表达与vacAm1亚型的表达呈正相关，且其表达水平与肿瘤分化程度有关。提示vacAm1亚型表达阳性的H.pylori感染可能通过促进MEX3A表达，抑制CDX2胃肠道保护因子，并参与cyclin D1、survivivin、Bcl-2等明星分子调控，影响胃癌细胞极性，促进胃癌细胞的增殖，影响胃癌凋亡。本研究仅在H.pylori阳性胃癌组织中检测了MEX3A的表达，仍存在一定的局限性，未来需要通过体外细胞实验进一步验证该结论。

综上所述，本研究发现辽宁地区H.pylori阳性胃癌患者的癌组织中，vacAm1为优势基因亚型，且其表达与MEX3A相关，可能通过参与调控相关细胞信号通路影响胃癌的发生、发展。